本发明属于生物技术领域的一种超声波辅助酶法提取肠激酶工艺。
背景技术：
外源蛋白的表达方式可分为直接表达和融合表达两种，其中利用融合表达方式往往能实现外源目的蛋白的高效表达，且利于分离纯化。但有时目的蛋白不能以融合蛋白的形式被使用，因此需要在目的蛋白和标签蛋白之间设计特异的蛋白酶酶切位点，利用独特的蛋白酶切割，才能得到完整的目的蛋白。目前常见的工具蛋白酶有肠激酶，xa因子或凝血酶等，其中肠激酶由于其能完全去除目的蛋白的n端序列，而最常被使用。（gasparian,m.etal.expression,purification,andcharacterizationofhumanenteropeptidasecatalyticsubunitinescherichiacoli.proteinexprpurif.2003,31(1),133-9）。
肠激酶（enteropeptidase，ep或enterokinase，ek，ec3.4.21.9）是存在于脊椎动物十二指肠内的一种异源二聚体（heterodimeric）丝氨酸蛋白酶。分子量为150kda，由1条115kda的重链和1条35kda的轻链组成，在ph值4.5-9.5，温度4-45℃范围内特异性水解蛋白底物（lavallie,e.r..etal.cloningandfunctionalexpressionofacdnaencodingthecatalyticsubunitofbovineenterokinase.jbiolchem.1993,268(31),23311-7）。由于ep裂解融合蛋白所释放出的多肽具有和野生型完全一致的n-末端氨基酸序列，因而可以作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂（schmidt,f.r.recombinantexpressionsystemsinthepharmaceuticalindustry.applmicrobiolbiotechnol.2004,65(4),363-72）。但是天然的肠激酶来源有限，并且提取分离的成本高，加之天然提取的肠激酶易被其它蛋白酶污染，易造成切割融合蛋白同时又降解了目的产物。而基因工程技术正可以弥补这些不足，因而运用基因工程的方法生产肠激酶已成趋势。
目前已经采用了原核或真核表达系统成功得到了有生物活性的重组猪、牛、小鼠等肠激酶轻链蛋白，但很少关于鳉鱼肠激酶轻链基因工程方面的研究。（kitamoto,y.etal.cdnasequenceandchromosomallocalizationofhumanenterokinase,theproteolyticactivatoroftrypsinogen.biochemistry.1995,34(14),4562-8；matsushima,m.etal.structuralcharacterizationofporcineenteropeptidase.jbiolchem.1994,269(31),19976-82；yahagi,n.etal.complementarydnacloningandsequencingofratenteropeptidaseandtissuedistributionofitsmrna.biochembiophysrescomm/lun.1996,219(3),806-12）
国外已有大量关于牛肠激酶研究的报道，但有关鳉鱼肠激酶研究很少。有研究表明，鳉鱼肠激酶的特异性要远高于目前常见的牛肠激酶、猪肠激酶和人肠激酶（ogiwara,k.specificityofthemedakaenteropeptidaseserineproteaseanditsusefulnessas
abiotechnologicaltoolforfusion-proteincleavage.procnatlacadsciusa.2007,104(17),7021-6）。其对非特异多肽底物的酶切活性不到牛肠激酶的1/100，因此，如果能利用基因工程方法得到重组鳉鱼肠激酶，其应用价值将比重组牛肠激酶更高。目前，重组鳉鱼肠激酶轻链尚无商业化产品。
由于鳉鱼肠激酶轻链中含有9个半胱氨酸（cys）残基，其中形成4对二硫键，有一个游离的cys残基不参加配对，因此在重组表达时，极易形成二硫键错配，导致异构体出现。已有文献报道，将游离的cys残基突变可能会有助于蛋白质的复性折叠（ivanenkov,v.bacterialexpression,characterization,anddisulfidebonddeterminationofsolublehumanntpdase6(cd39l2)nucleotidase:implicationsforstructureandfunction.biochemistry.2003,42(40),11726-35）。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型的重组鳉鱼肠激酶轻链突变体，并提供其在大肠杆菌中高效表达、复性、层析纯化的方法，该方法适用于鳉鱼肠激酶轻链的大规模制备。
本发明在已报道的鳉鱼肠激酶轻链的核苷酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则的基础上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），设计编码新型鳉鱼肠激酶轻链氨基酸的核苷酸序列，进行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用变复性与纯化技术得到高活力的mepl融合蛋白。这一新型鳉鱼肠激酶轻链带有c112s突变。
本发明是通过一下技术方案实现的：
一种超声波辅助酶法提取肠激酶工艺，其特征在于：用超声波辅助酶法提取肠激酶，具有seqidno：2所示的氨基酸序列；所述seqidno：1的氨基酸序列含有核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体为含有t7启动子的载体；所述的载体为pet32；所述的载体为一种宿主细胞，为原核细胞；所述的宿主细胞为大肠杆菌。
超声波辅助酶法提取肠激酶工艺的方法包括：
a）根据蛋白分子的空间结构，将鳉鱼肠激酶轻链野生型基因易形成二硫键错配的半胱氨酸进行突变，全基因合成mepl核苷酸序列；
b）构建含有人工合成的mepl基因的重组质粒ptrx-d-mepl；
c）将重组质粒ptrx-d-mepl转化至权利要求5、6任一所述的宿主细胞中，得到含有重组质粒的宿主细胞；
d）在表达条件下，培养宿主细胞，表达新型重组鳉鱼重组肠激酶轻链；
e）层析纯化得到目标蛋白mepl。
与现有技术相比，本发明的优点和效果：
本发明首次实现了新型鳉鱼肠激酶轻链的重组表达，经复性纯化后每升发酵液可获得
100mg纯度在95%以上的mepl蛋白，活性检测其活性为ekmaxtm的2倍，特异性为ekmaxtm的80倍以上，无论表达量还是特异性，都是目前已有报告中最高的（ostapchenko,v.g.etal.dissectingstructuralbasisoftheuniquesubstrateselectivityofhumanenteropeptidasecatalyticsubunit.jbiomolstructdyn.2012,30(1),62-73）。
本发明提供的一种高特异性重组鳉鱼肠激酶轻链，以及一种高效生产重组鳉鱼肠激酶轻链的生产方法，采用大肠杆菌表达系统，通过简单的复性和纯化，获得快速、简便、稳定、高活性、高特异性的重组鳉鱼肠激酶轻链蛋白。该酶适用于生物制药工程、基因工程、生物化学和分子生物学等领域的而研究和应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容作进一步的说明：
实施例：
鳉鱼肠激酶突变体的构建通过查找genbank中鳉鱼肠激酶序列(mn_001104898)，利用大肠杆菌的密码子偏爱性对其序列进行优化，设计编码新型鳉鱼肠激酶轻链(c112s)的核苷酸序列，将鳉鱼肠激酶轻链的第112位cys被置换为丝氨酸(ser)，其核苷酸序列见序列表seqidno:1，其核苷酸与鳉鱼体内野生型序列，黑底区为根据大肠杆菌密码子偏爱性来优化后改变的基因，选择性突变位点用黑色三角形标出。该人工合成鳉鱼肠激酶轻链基因长度。