一种高活性壳聚糖酶控制基因csn及利用该基因生产高活性壳聚糖酶的方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，提供了一种高活性壳聚糖酶控制基因csn及利用该基因生产高活性壳聚糖酶的方法。

背景技术：

甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物，经脱乙酰基后产物为壳聚糖。壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，但是由于壳聚糖水溶性差，难以发挥其应有的生物活性，大大限制了壳聚糖的应用范围。近年来发现壳聚糖的降解产物壳寡糖具有独特的生理功能，壳寡糖由2-20个单糖通过糖苷键连接，具有水溶性好、生物学活性强(是同等质量壳聚糖的十倍以上)等优点，被科学界誉为“第六大生命元素”，在医药领域、食品领域、农业领域、日用化工领域、生物兽药领域及饲料添加剂领域具有非常广泛的潜在应用价值。因此，有关壳寡糖的研究及生产受到广大科研工作者的高度重视，也取得了丰硕的成果。

目前壳寡糖常见的生产方法有物理降解法和化学降解法。物理降解法常见的是超声波降解法，通过超声波降解壳聚糖制备壳寡糖，反应过程温和，可在低温下进行，环境污染较小，但是最终产物中低分子量的水溶性产物收率很低，再加上该法成本过高，所以物理降解法难以工业化应用。目前工业化生产壳寡糖的传统方法是化学降解法，即酸法水解制备壳寡糖，壳聚糖在酸性条件下不稳定，会发生长链的部分水解，即糖苷键断裂，形成许多相对分子质量不等的片段。酸法水解制备壳寡糖是一种比较成熟的方法，是最早用于工业化生产壳寡糖的方法，该方法的技术要求相对较低，降解速度快，设备、原料成本较低，非常适合工业化生产；然而，该方法存在后处理工艺繁琐，环境污染严重等缺点，最严重的是制备的壳寡糖产物中单糖含量高，三聚以上寡糖收率低，分子量分布宽，副产物多，使产品安全性饱受质疑。

随着生物技术的不断发展，壳聚糖酶水解法逐渐被应用于壳寡糖的制备。壳聚糖酶通常由微生物发酵制备，常见于细菌和真菌的代谢产物中。壳聚糖酶属水解酶类，以内切作用方式专一性水解壳聚糖分子中的β-1,4糖苷键，生成聚合度为3-8的壳寡糖。以壳聚糖酶水解法制备壳寡糖，反应条件温和，易于控制，产物分子量分布均匀，聚合度为3-8的寡糖收率达90％以上，单糖含量非常低，生产过程无需加入大量化学试剂，对环境污染小，而且无其它副产物，保证了产品安全性，是一种“绿色”的壳寡糖生产方法。

传统的壳聚糖酶生产方法是通过自然界野生菌自然发酵获得，不同的菌种发酵条件、发酵形式不一，并且野生菌发酵条件不成熟，存在产酶活力低、产酶周期长、难以纯化处理、难实现商品化等缺点，直接限制了酶水解法制备壳寡糖工艺的工业化应用，例如：程仕伟等在鲜虾表面筛选并鉴定出产壳聚糖酶菌—产气肠杆菌，其产壳聚糖酶最高酶活为15.8U/mL；王艳君等于泥样中分离并鉴定出产壳聚糖酶菌株—青霉菌，并对其产酶条件进行优化，发酵培养72h，酶活最高为18U/mL。随着科学技术的进步，也有学者尝试利用基因工程技术手段提高壳聚糖酶活力，如Yabuki.M等利用嗜热芽孢杆菌的壳聚糖酶基因构建重组工程菌，经高密度发酵后壳聚糖酶酶活最高达1051U/mL，酶活水平提高数倍，但是上述获得的各种菌株仍不能满足工业化要求。因此，筛选产高活力壳聚糖酶菌株，并利用先进的生物技术手段不断改进提高壳聚糖酶活力，是实现壳聚糖酶水解法制备壳寡糖工艺工业化的关键。

技术实现要素：

本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种高活性壳聚糖酶控制基因csn及利用该基因生产高活性壳聚糖酶的方法。本发明所涉及的高活性壳聚糖酶控制基因csn来源于保藏号为CGMCC No.6129的蜡状芽孢杆菌中，发明人利用该高活性壳聚糖酶控制基因csn构建异源表达载体，并转入宿主大肠杆菌BL21体内，实验表明利用该大肠杆菌BL21进行高密度发酵，可获得高活性壳聚糖精酶，酶活500000U/g以上，且生产工艺简单、可控性强，适于工业化生产。

本发明首先提供了一种高活性壳聚糖酶控制基因csn，所述的高活性壳聚糖酶控制基因csn，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示；所述的高活性壳聚糖酶控制基因csn来源于蜡样芽孢杆菌JBSH-003，该菌株在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.6129。

该基因的获取方法如下：

⑴目的基因的获得：

设计上游引物F：GCGCCATATGAAAATCAGTATGCAAAAAGC，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示，下游引物R：GCGCGAATTCTTATTTGATTACAAAATTACCGT，其核苷酸序列如Seq ID No:4所示；以蜡状芽孢杆菌基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，验证正确后进行胶回收得到基因片段，然后将该片段与载体进行平末端连接，构建克隆载体；将克隆载体通过物理方法转入大肠杆菌DH5α体内，并将菌液涂布于含有Ampicillin的LB固体培养基上，32℃～37℃，静置培养10h，获得阳性转化子，将阳性转化子测序、比对分析；结果显示目的基因序列含有834个碱基，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，编码277个氨基酸，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示，

其中所采用的克隆载体选自pMD-T系列或pUC系列载体；

获得上述目的基因后，发明人利用该基因转入了常用的工程菌以验证其功能：

将目的基因csn从阳性转化子中提取出来并于30～37℃水浴条件下经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切30min，利用胶回收试剂盒将酶切过后的基因csn回收，然后在T4DNA连接酶作用下与表达载体相连，构建异源表达载体；将异源表达载体通过物理法转入宿主大肠杆菌BL21体内，将菌液涂布于含有Kanamycin的LB固体培养基上，32℃～37℃，静置培养10h，获得阳性转化子，即得生产高活性壳聚糖酶的工程菌株；

其中构建异源表达载体是所采用的为pET系列或pGEM系列载体；

除了上述采用的宿主大肠杆菌BL21之外，还可以采用其他宿主，如大肠杆菌DH5α、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌。

发明人还提供了高活性壳聚糖酶控制基因csn生产高活性壳聚糖酶的方法，包括以下步骤，以大肠杆菌BL21为例：

⑴种活化：在无菌操作台上，取1～5μl冻存的上述获得的生产高活性壳聚糖酶的工程菌于含有LB液体培养基的试管内，32℃～37℃，130～180rpm培养10h；

⑵种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体培养基的三角瓶内，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后32℃～37℃，130～180rpm培养10h；

⑶接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min；待温度降至32℃～37℃时进行接种；

⑷发酵条件：接种量v/v 5％～10％；培养温度35℃～37℃；pH：7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05Mpa；通气量比：1:1；补料：浓度为50vt％的甘油水混合物；发酵周期：45～50h；

⑸诱导：当发酵液OD600＝40～60时，加入终浓度为0.1～0.4mmol/L的诱导剂IPTG，诱导目标基因csn大量表达；

⑹自加入诱导剂始，每2h取样一次，并利用DNS法检测酶活，当酶活连续4h不再升高时停止发酵，并放罐，获得发酵菌液；

⑺破壁处理：利用高压均质机对发酵菌液进行菌体破壁处理，设置压力90～120Mpa之间，流速60L/h，通过破壁处理，将菌体细胞内大量的壳聚糖酶释放到胞外，获得壳聚糖酶粗酶液。

其中步骤(2)和(3)中所述培养基的配方按重量份计为：1.0～1.5份蛋白胨，2.0～2.5份酵母提取物，0.4～0.6份甘油，0.2～0.3份磷酸氢二钾，1.0～1.3份磷酸二氢钾，93.8～95.4份软化水；

步骤(4)中所述50vt％的甘油水混合物中还含有g/v为2％的硫酸镁。

上述获得的壳聚糖酶粗酶，最终壳聚糖酶粗酶破壁率达90％，经DNS法酶活测定，其酶活为7000～9000U/ml。

为了进一步提高壳聚糖酶的品质，发明人还公开了对上述壳聚糖酶粗酶液的精制处理，以获得高活性壳聚糖精酶，具体步骤如下：

⑴利用离心机离心将获得粗酶液进行固液分离，离心转速4000rpm，离心10min，收集清液；

⑵对离心后的清液通过0.22um微滤膜进行微滤处理，进一步去掉菌体和微小颗粒杂质；微滤液再经6000Dalton的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍率1/5～1/10，收集超滤内液；

⑶向超滤内液内加入超滤内液体积30％～50％的95％的乙醇，常温下进行醇沉，醇沉后离心，收集沉淀，得到湿固酶；

⑷干燥：将得到的湿固酶在50℃条件下真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶。经DNS法酶活测定，其酶活为500000U/g以上。

经过计算，整个工艺过程酶活的综合回收率为75％以上，所得纯化高活性壳聚糖酶酶活达500000U/g以上；另外，所得高活性壳聚糖酶温度及酸碱度适应范围广，在40℃～65℃均具有较高的生物活性，在pH值4.5～6.5之间具有很强的酶学活性。

由上可知本发明所获得的壳聚糖酶精酶酶活达500000U/g，而蜡状芽孢杆菌JBSH-003发酵产壳聚糖酶精酶酶活水平为25000U/g，因此，本发明最终所得壳聚糖酶精酶酶活水平较原出发菌株提高了20倍以上；本发明采用的工程菌宿主优选采用大肠杆菌BL21，其为模式菌株，高密度发酵条件成熟，发酵最大菌体密度较蜡状芽孢杆菌JBSH-003高数倍，另外，大肠杆菌发酵周期为45～50h，而蜡状芽孢杆菌JBSH-003发酵周期为72～96h，因此在发酵成本上要比原出发菌株低很多。

与现有技术相比，本发明利用利用高活性壳聚糖酶控制基因csn构建生产高活性壳聚糖酶的工程菌，同时提供了利用该菌株进行高密度发酵生产高活性壳聚糖酶的生产方法，取得了以下有益之处：⑴通过表达载体的构建，将目的基因csn进行改造、重组，转入宿主菌体内，在诱导剂诱导条件进行大量表达，表达量是其在原出发菌株体内的数十倍；⑵选择大肠杆菌BL21作为宿主菌进行构建生产高活性壳聚糖酶的工程菌株，大肠杆菌BL21为模式菌株，高密度发酵条件成熟，产酶周期短，被广泛应用于微生物发酵工业领域；⑶所获得高活性壳聚糖酶粗酶液酶活力高，经DNS法酶活测定达8000U/ml，较之前平均水平提高数倍；⑷该方法生产壳聚糖粗酶后期经纯化处理后即可获得了高活性壳聚糖酶精酶，经DNS法酶活测定达500000U/g，所采用的工艺简单实现了商品化生产的要求；⑸该方法获得高活性壳聚糖酶，酶活力大大提高，可应用于酶水解法生产壳寡糖工艺的工业化应用。

附图说明

图1为本发明所述高活性壳聚糖控制基因csn的电泳结果示意图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1目的基因的获得

设计上游引物F：GCGCCATATGAAAATCAGTATGCAAAAAGC，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示，下游引物R：GCGCGAATTCTTATTTGATTACAAAATTACCGT，其核苷酸序列如Seq ID No:4所示；以蜡样芽孢杆菌基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，所述的蜡样芽孢杆菌基因组DNA来源于蜡样芽孢杆菌JBSH-003，该菌株在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.6129；

采用单因子实验和正交实验，通过改变PCR扩增体系中加入引物的量、基因组DNA的量以及PCR扩增条件退火温度(TM)，来确定最佳的PCR扩增体系和条件，以得到单一、足量的扩增产物；经优化，最终的扩增体系和扩增条件分别见表1和表2：

表1.PCR扩增体系(50μl)

表2.PCR扩增条件

构建克隆载体

将PCR扩增产物通过琼脂糖水平电泳验证，验证正确后利用“琼脂糖凝胶回收试剂盒”进行目的基因片段回收，将获得的基因片段与pMD19-T vector在16℃下进行平末端连接(连接体系见表3)，获得克隆载体。

表3.克隆载体连接体系(10μl)

将克隆载体转入大肠杆菌DH5α体内，并将菌液涂布于含有Ampicillin的LB固体培养基上，37℃静置培养10h，获得阳性转化子。并将阳性转化子测序、比对分析，测序结果显示，获得的目的基因序列含有834个碱基，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，编码277个氨基酸，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示；最终将该基因命名为csn。电泳检测结果如图1所示。

实施例2生产高活性壳聚糖酶的工程菌株构建

选择大肠杆菌BL21为宿主菌，选择pET-30b vector与目的基因csn相连构建表达载体，首先利用限制性内切酶NdeI和EcoRI在37℃下进行双酶切，使pET-30b vector和csn形成相同的粘性末端，然后利用T4DNA连接酶将二者连接(连接体系见表4)，16℃下连接过夜。

表4.表达载体连接体系(10μl)

将连接产物转入大肠杆菌BL21体内，并将菌液涂布于含有Kanamycin的LB固体培养基上，37℃静置培养10h，获得阳性转化子，即生产高活性壳聚糖酶的工程菌株。

实施例3高密度发酵获得高活性壳聚糖酶

以实施例2获得的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株作为菌种进行高密度发酵，发酵菌液经破壁处理后，经DNS酶活测定法测定获得的壳聚糖粗酶液酶活。

具体如下：

⑴菌种活化：在无菌操作台上，取5μl冻存的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株种于含有LB液体培养基的试管内，37℃，150rpm培养10h。

⑵种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体培养基的三角瓶内，培养基配方为：1.2份蛋白胨，2.4份酵母提取物，0.4份甘油，0.23份磷酸氢二钾，1.25份磷酸二氢钾，94.52份软化水，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后37℃，150rpm培养10h。

⑶接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，培养基配方为：1.2份蛋白胨，2.4份酵母提取物，0.4份甘油，0.23份磷酸氢二钾，1.25份磷酸二氢钾，94.52份软化水。然后对培养基进行实消，121℃，实消30min。待温度降至37℃时进行接种。

⑷发酵条件：接种量5vt％；培养温度37℃；pH：7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05Mpa；通气量比：1:1；补料：50vt％的甘油水混合物(含2vt％硫酸镁)；

⑸诱导：当发酵液OD600＝60左右时，加入终浓度为0.2mmol/L的诱导剂IPTG，并将培养温度控制在30℃。

⑹放罐：自加入诱导剂始，每2小时取样检测酶活，当酶活持续4小时不再升高，此时发酵时间为45h，结束发酵并放罐。

⑺利用高压均质机对发酵菌液进行破壁处理，获得壳聚糖粗酶液，经DNS法酶活测定，酶活为8100U/ml。

实施例4高密度发酵获得高活性壳聚糖酶

以实施例2获得的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株作为菌种进行高密度发酵，发酵菌液经破壁处理后，经DNS酶活测定法测定获得的壳聚糖粗酶液酶活。

具体如下：

⑴菌种活化：在无菌操作台上，取5μl冻存的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株种于含有LB液体培养基的试管内，35℃，150rpm培养10h。

⑵种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体培养基的三角瓶内，1.4份蛋白胨，2.0份酵母提取物，0.5份甘油，0.25份磷酸氢二钾，1.3份磷酸二氢钾，94.55份软化水，每三角瓶内分装200ml该培养基。一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后35℃，150rpm培养10h。

⑶接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，培养基配方为：1.4份蛋白胨，2.0份酵母提取物，0.5份甘油，0.25份磷酸氢二钾，1.3份磷酸二氢钾，94.55份软化水，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min，待温度降至37℃时进行接种。

⑷发酵条件：接种量5.5vt％；培养温度35℃；pH：7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05Mpa；通气量比：1:1；补料：50vt％的甘油水混合物(含2vt％硫酸镁)；

⑸诱导：当发酵液OD600＝50左右时，加入终浓度为0.35mmol/L的诱导剂IPTG，并将培养温度控制在28℃。

⑹放罐：自加入诱导剂始，每2小时取样检测酶活，当酶活持续4小时不再升高，此时发酵时间为48h，结束发酵并放罐。

⑺利用高压均质机对发酵菌液进行破壁处理，获得壳聚糖粗酶液，经DNS法酶活测定，酶活为8350U/ml；

为了进一步提高壳聚糖酶的品质，发明人对上述壳聚糖酶粗酶液进行了精制处理，具体步骤如下：

⑴利用离心机离心将获得粗酶液进行固液分离，离心转速4000rpm，离心10min，收集清液；

⑵对离心后的清液通过0.22um微滤膜进行微滤处理，进一步去掉菌体和微小颗粒杂质；微滤液再经6000Dalton的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍率1/5-1/10，收集超滤内液；

⑶向超滤内液内加入超滤内液体积30％～50％的95％的乙醇，常温下进行醇沉，醇沉后离心，收集沉淀，得到湿固酶；

⑷干燥：将得到的湿固酶在50℃条件下真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶。经DNS法酶活测定，其酶活为500000U/g以上。

实施例5.高密度发酵获得高活性壳聚糖酶

以实施例2获得的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株作为菌种进行高密度发酵，发酵菌液经破壁处理后，经DNS酶活测定法测定获得的壳聚糖粗酶液酶活。

具体如下：

⑴菌种活化：在无菌操作台上，取5μl冻存的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株种于含有LB液体培养基的试管内，32℃，150rpm培养10h。

⑵种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体培养基的三角瓶内，1.5份蛋白胨，2.5份酵母提取物，0.6份甘油，0.3份磷酸氢二钾，1.3份磷酸二氢钾，93.8份软化水，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后32℃，150rpm培养10h。

⑶接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，培养基配方为：1.5份蛋白胨，2.5份酵母提取物，0.6份甘油，0.3份磷酸氢二钾，1.3份磷酸二氢钾，93.8份软化水，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min，待温度降至32℃时进行接种。

⑷发酵条件：接种量6vt％；培养温度32℃；pH：7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05Mpa；通气量比：1:1；补料：50vt％的甘油水混合物(含2vt％硫酸镁)；

⑸诱导：当发酵液OD600＝45左右时，加入终浓度为0.4mmol/L的诱导剂IPTG，并将培养温度控制在28℃。

⑹放罐：自加入诱导剂使，每2小时取样检测酶活，当酶活持续4小时不再升高，此时发酵时间为50h，结束发酵并放罐。

⑺利用高压均质机对发酵菌液进行破壁处理，获得壳聚糖粗酶液，经DNS法酶活测定，酶活为7950U/ml。

比较例1.生产高活性壳聚糖酶的工程菌株与原出发菌株产壳聚糖酶酶活及发酵时间比较

以实施例3中的培养基配方及发酵条件对本发明提供的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株及原出发菌株-蜡状芽孢杆菌JBSH-003进行发酵实验，比较二者所产壳聚糖酶酶活及最佳发酵周期。

具体如下：

⑴菌种活化：在无菌操作台上，分别取5μl冻存的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株种和蜡状芽孢杆菌JBSH-003于两支含有LB液体培养基的试管内，37℃，150rpm培养10h。

⑵种子制备：在无菌操作台上，将活化的菌种转入含有灭菌液体培养基的三角瓶内，培养基配方为：1.2份蛋白胨，2.4份酵母提取物，0.4份甘油，0.23份磷酸氢二钾，1.25份磷酸二氢钾，94.52份软化水，每三角瓶内分装200ml该培养基，一支活化的试管菌种接种一个三角瓶，然后37℃，150rpm培养10h。

⑶接种发酵罐：首先将发酵罐罐体、管线、空气过滤器进行空消，121℃，空消30min，待温度降低后，注入培养基，培养基配方为：1.2份蛋白胨，2.4份酵母提取物，0.4份甘油，0.23份磷酸氢二钾，1.25份磷酸二氢钾，94.52份软化水，然后对培养基进行实消，121℃，实消30min，待温度降至37℃时进行接种。

⑷发酵条件：接种量5％；培养温度37℃；pH：7.0；初始转速：200rpm；发酵罐压：0.05Mpa；通气量比：1:1；50vt％的甘油水混合物(含2vt％硫酸镁)；

⑸诱导：当生产高活性壳聚糖酶的工程菌株发酵液OD600＝60左右时，加入终浓度为0.2mmol/L的诱导剂IPTG，并将培养温度控制在30℃。

⑹放罐：自发酵42h起，每2小时取样检测酶活，当酶活持续4小时不再升高，结束发酵并放罐。每次取样经高压均质机破壁处理，并经DNS法测定样品粗酶酶活。

检测结果如下表：

从上表可以发现，本发明提供的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株在发酵46h时，所得壳聚糖酶粗酶酶活达最大8125U/mL，而蜡状芽孢杆菌JBSH-003在发酵72h时，所得壳聚糖酶粗酶酶活达最大405U/mL，所以可以得出结论：本发明提供的一种高活性壳聚糖酶基因csn构建的生产高活性壳聚糖酶的工程菌株，所生产的壳聚糖酶酶活水平高，发酵周期短，且生产工艺简单、可控性强，适于工业化生产。