一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用的制作方法

本发明涉及一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术：

噻虫啉、啶虫脒均属烟碱类杀虫剂，是烟碱型乙酰胆碱受体的作用体，目前在农业生产中已广泛使用，噻虫啉属低毒类杀虫剂，啶虫脒属中毒杀虫剂。此两种药主要作用于昆虫神经接合后膜，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。具有较强的触杀、胃毒和内吸作用。多用于水果、蔬菜等防除大多数害虫。有文章报道，烟碱类杀虫剂暴露可能会对哺乳动物神经系统的发育产生影响。在欧盟食品安全局（EFSA）审查发现烟碱类杀虫剂对蜜蜂有害之后，近两年欧盟已限制了烟碱类杀虫剂药在一些作物上的使用。

目前检测噻虫啉、啶虫脒色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的噻虫啉、啶虫脒检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种噻虫啉、啶虫脒具有高特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。提供一株抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对噻虫啉、啶虫脒具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立噻虫啉、啶虫脒的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12014。

抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12014的噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW分泌产生。

所述抗噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中噻虫啉、啶虫脒的分析检测。

本发明提供的GW细胞株的制备基本步骤为：

1）半抗原的合成：

将啶虫脒原药1 （2.2g，10 mmol），巯基丙酸（2.12 g，2eq），Cs2CO3（32.6g，10eq）混悬于己二酸二甲酯（40mL）中，120℃下反应16 h（过夜），冷至室温，加入四氢呋喃（50 mL）后过滤，所得固体粗品（35g，易吸潮）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到70mg半抗原ATPA。用液质联用分析法进行鉴定与分析；

2）完全抗原ATPA-BSA的制备：称取5 mg ATPA，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）12mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）7mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。称取10mg 牛血清蛋白BSA，溶解于2 mL硼酸（BB）缓冲溶液中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物ATPA-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

3）小鼠的免疫：完全抗原ATPA-BSA与等量QuickAntibody-Mouse 5W佐剂（北京博奥龙免疫技术有限公司）混合均匀，通过大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加强免疫50μg/只，每次免疫间隔21天，最后一次用噻虫啉、啶虫脒完全抗原ATPA-BSA（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW；

5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对噻虫啉、啶虫脒具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值分别为0.1ng/mL、0.4ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中噻虫啉、啶虫脒残留量的检测，为食品中噻虫啉、啶虫脒残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株GW，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12014，保藏日期2016年1月20日。

附图说明

图1. GW单克隆抗体对噻虫啉的抑制标准曲线。

图2. GW单克隆抗体对啶虫脒的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将噻虫啉、啶虫脒完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对噻虫啉、啶虫脒有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 噻虫啉、啶虫脒单克隆抗体杂交瘤细胞株GW的制备

（1）半抗原的合成：将啶虫脒原药1 (2.2g，10mmol），巯基丙酸（2.12g，2eq），Cs2CO3（32.6g，10eq）混悬于DMA（40mL）中，120℃下反应16h（过夜），冷至室温，加入四氢呋喃（50mL）后过滤，所得固体粗品（35g，易吸潮）加入少量水中，prep-HPLC纯化，最后得到70mg半抗原ATPA。用液质联用分析法进行鉴定与分析。

（2）完全抗原的合成：称取5mg ATPA，EDC 12mg，NHS 7mg，用300μL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应8h。称取10mg BSA，溶解于2mL BB缓冲溶液中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物ATPA-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。完全抗原ATPA-BSA与等量QuickAntibody-Mouse 5W佐剂混合均匀，通过大腿肌肉注射BALB/c小鼠。首次免疫100μg/只，多次加强免疫50μg/只，每次免疫间隔21天，第二次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第四次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0瘤细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用噻虫啉、啶虫脒为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞孔进行抑制效果测定。选择对噻虫啉、啶虫脒标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株GW。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG 型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

6.1包被：将包被原ATPA-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从1 µg/mL开始倍比稀释，100 μL/孔，37℃反应2 h；

6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；

6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃反应1h；

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15 min；

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体对噻虫啉、啶虫脒的IC50分别为：0.1 ng/mL、0.4ng/mL，说明抗体对噻虫啉、啶虫脒有很好的灵敏度，可用于噻虫啉、啶虫脒免疫分析检测。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na2HPO4^.12H2O 18.43 g，柠檬酸 9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用

现混。

表1.杂交瘤细胞株GW单克隆抗体的交叉反应率

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