技术领域本发明属于纳米材料及医学领域，具体涉及一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌诊断方法及试剂盒。
背景技术：
磁性、生物靶向功能纳米微球已经实现了对核酸、病毒、细菌、蛋白分子和肿瘤细胞的检测，并得到广泛报道和生物医学领域的应用。Xie等人(Fluorescent-magneticdual-encodednanospheres:apromisingtoolforfast-simultaneous-addressablehigh-throughputanalysis，Nanotechnology，2012，23(3)，第035602页)首次用层层组装法实现了微纳球的磁性、荧光和生物靶向三重编码。Wen等人(Quick-ResponseMagneticNanospheresforRapid,EfficientCaptureandSensitiveDetectionofCirculatingTumorCells，Acs.Nano.，2014，8(1),第941-949页)用简便的、高效可控的层层组装策略构建了一种磁性纳米微球，这种纳米尺寸的微球磁响应迅速，1min内可以被商品化的磁力架全部吸引，此外，磁性纳米微球还具备良好的单分散性，在血液中不会发生团聚和沉淀，以单分散态100％被回收。偶联了EpCAM抗体的磁球通过抗原抗体的作用成功的捕获了全血中极少的肿瘤细胞，孵育5min捕获率达到94％，磁分选后的肿瘤细胞仍保持较高的活性，可养活率为90.5％，可以用来再培养、RT-PCR、ICC鉴定等分析。将这种磁性纳米微球应用于癌症患者全血中CTCs的检测，成功的检测到了低至1个循环肿瘤细胞，显示了较高的灵敏度和良好的重现性。作为一种肿瘤细胞富集和检测工具，磁性纳米微球拥有广阔的应用前景。恶性肿瘤由于其侵袭和转移的特性严重威胁着人类的生命安全，而癌症早期恶性肿瘤细胞主要通过淋巴道转移，所以细针淋巴结穿刺(FNA)检查成为临床上区分反应性增生、恶性淋巴瘤或转移性癌的重要手段之一。因为FNA是一种微小的活检，因此也有人称它为ABC(aspirationbiopsycyology)，即针吸活检细胞学，不仅能观察单个细胞的形态，更能观察细胞团内细胞的排列和生长方式，它提供了远比脱落细胞学为多的信息。据此不仅能判断肿瘤性疾病，也能诊断非肿瘤性疾病；不仅能断定肿瘤的良、恶性，还能判断其组织学类型，为做出类似病例组织学的诊断提供了可能性。这也是目前FNA诊断的基本趋势。Zhang等人(颈部淋巴结细针穿刺细胞学检查的临床应用(Applicationoffine-needleaspitationcytologyincervicallymphnodes)，肿瘤防治杂志(ChinJCancerPrevTreat)，2005,12(23)，第1775-1778页)对931例颈部肿大淋巴结的细针穿刺诊断进行，回顾性分析发现FNA检查的敏感度仅为82.5％，其中对转移癌的诊断敏感度为92.6％，总准确率为95.7％。从这一结果看来针吸细胞学检查虽然是一种可靠、准确率较高的淋巴结病理诊断方法，但是仍然存在读片依赖医生主观判断、穿刺标本有限以及对不典型细胞难以区分诊断等因素造成假阴性率和假阳性率过高等问题亟待解决。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法。基于该收集方法，本发明的另一目的在于提供一种快速、准确诊断淋巴结转移癌的方法，以提高穿刺细胞学诊断淋巴结转移癌的准确率。本发明的目的还在于提供可以实现上述方法的试剂盒。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌细胞的收集方法，包括如下步骤：将免疫磁球(IMNs)加入到转移癌病人的淋巴结穿刺物中，20～37℃轻摇孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗涤获得癌细胞。所述的免疫磁球为修饰了抗上皮粘附分子(EpCAM)抗体的磁性纳米球；所述的磁性纳米球为表面组装了5层磁性纳米粒子的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，其粒径为429nm。一种基于免疫磁球的淋巴结转移癌的诊断方法，包括如下步骤：将免疫磁球加入到含有转移癌病人淋巴结穿刺物的1×PBS溶液中，20～37℃轻摇孵育5～10min，磁分选并用1×PBS洗涤2次，然后将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到粘附载玻片上疏水笔划定的区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察快速做出诊断。一种收集淋巴结转移癌细胞的试剂盒，包含上述免疫磁球、PBS和磁力架。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1×PBS中，加入免疫磁球20～37℃轻摇孵育5～10min，然后用磁力架进行磁分选并用1×PBS缓冲溶液洗涤，获得癌细胞。一种淋巴结转移癌的诊断试剂盒，包含上述免疫磁球、PBS、磁力架、粘附载玻片、瑞氏染色试剂。上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：将转移癌病人的淋巴结穿刺物分散于1mL1×PBS中，加入免疫磁球20～37℃轻摇孵育5～10min，然后用磁力架进行磁分选并用1×PBS洗涤，最后分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定的区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。上述试剂盒还包含离心管、移液枪等。本发明具有如下有益效果：(1)本发明方法通过免疫磁分选的方法可实现特异性捕获穿刺物中的转移癌细胞(上皮来源)，无需进行磁球释放，涂在玻片上便于后续的一系列观察和鉴定，包括瑞氏染色观察癌细胞形态、免疫细胞化学鉴定、免疫组织化学鉴定以及荧光原位杂交技术的分子水平鉴定。(2)本发明方法可实现极少量淋巴结穿刺物中稀少癌细胞的检测，操作简便、省时，对标本的损失较少，灵敏度高。诊断结果一目了然，便于观察。(3)本发明方法解决了仅从细胞形态上难以区别诊断反应性增生、恶性淋巴瘤和转移性癌的问题，提高了诊断的敏感度、特异度和诊断准确度。且磁分选过程对癌细胞形态和细胞环境影响较小，仍能保留其病理学特征判据。附图说明图1为免疫磁球(IMNs)用于淋巴结穿刺物中癌细胞的检测示意图，其涂片可进行瑞氏染色、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)等鉴定。图2为磁性纳米球的表征结果。其中，(a)为磁性纳米球的透射电镜(TEM)图；(b)为磁力架在不同吸引时间下对磁性纳米球的捕获效率；(c)为磁性纳米球的水合粒径柱状图；(d)为室温保存12个月后磁性纳米球的水合粒径柱状图。图3为抗体筛选结果。其中，(a)为三种蛋白pCK、E-Cad和EpCAM在乳腺癌MCF-7细胞膜上的表达水平；(b)为EpCAM在乳腺癌MCF-7、淋巴细胞JurkatT和肝癌LM9细胞膜上的表达水平；左边是明场20倍镜下，右边为荧场20倍镜下。图4为MNs的吸光度、FITC-labeledmouseIgG的荧光强度对其浓度的标准曲线。其中，(a)为MNs在600nm处吸光度对其浓度(不同稀释倍数)的标准曲线；(b)为FITC-labeledmouseIgG的荧光强度对其浓度的标准曲线(加入与IMNs等量的MNs以扣除背景影响)。图5为不同情况下IMNs对细胞的捕获效率。其中，(a)为不同浓度下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(b)为不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(c)为IMNs对MCF-7细胞、IMNs对JurkatT细胞以及MNs对MCF-7细胞的捕获效率。图6为IMNs对混合细胞体系中低浓度癌细胞的捕获效率及磁分选前后细胞的荧场对比图。(a)为IMNs对含少量MCF-7细胞(MCF-7细胞浓度为5、50、100、500和1000个/mL，JurkatT细胞1×105个/mL)的混合体系中癌细胞的捕获效率；(b)为MCF-7:JurkatT＝1:100混合体系免疫磁分选前和(c)为免疫磁分选后的免疫荧光图。其中Hoechst33342核染料染细胞核，FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体鉴定MCF-7细胞，藻红蛋白(PE)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体鉴定JurkatT细胞。图7为免疫细胞化学(ICC)鉴定结果。(a)为MCF-7:JurkatT＝1:100混合体系免疫磁分选前和(b)为免疫磁分选后的三色免疫荧光图及叠加图。从左到右分别为Hoechst33342核染料、FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体、藻红蛋白(PE)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体。图8为不同孵育时间对癌细胞形态的影响。(a)为10倍镜下瑞氏染色观察不同孵育时间下癌细胞的形态；(b)为不同孵育时间对转移性鳞癌、腺癌和未分化癌细胞形态的影响。图9为四种干片方法对癌细胞形态的影响。(a-1)自然风干(a-2)热风吹干(a-3)钨灯烤干(a-4)37℃烘箱烘干；(b)为不同干片方法对转移性鳞癌、腺癌和未分化癌细胞形态的影响。图10为磁分选诊断淋巴结转移癌的实验流程图。图11为阴性对照和阳性对照实验结果。(a)为同一转移癌病人穿刺物(左)IMNs磁分选细胞涂片和(右)MNs磁分选细胞涂片；(b)为同一转移癌病人淋巴结穿刺物(左)直接涂片和(右)磁分选后涂片效果，其中绿色箭头所指为红细胞，红色箭头所指为上皮细胞，黑色箭头所指为纤维细胞。(瑞氏染色，20倍镜下)图12为免疫微球对不同类型转移癌细胞的捕获。(a-1，a-2)为转移性鳞癌磁分选细胞涂片，(a-3，a-4)为转移性腺癌磁分选细胞涂片；(b)为淋巴结转移癌，怀疑淋巴瘤，直接涂片(左)和磁分选涂片(右)。瑞氏染色，20倍镜下。图13为三种类型转移癌病人淋巴结穿刺物磁分选细胞涂片的瑞氏染色和ICC鉴定结果(a)转移性鳞癌；(b)转移性腺癌；(c)未分化癌。具体实施方式以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为本发明的实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换。实施例1快速诊断淋巴结转移癌将免疫磁球(IMNs)用于淋巴结穿刺细胞中癌细胞的检测示意图如图1所示，通过免疫磁分选的方法可实现特异性捕获穿刺物中的转移癌细胞(上皮来源)，无需进行磁球释放，涂在玻片上便于后续的一系列观察和鉴定，包括瑞氏染色观察癌细胞形态、免疫细胞化学鉴定、免疫组织化学鉴定以及荧光原位杂交技术的分子水平鉴定。下面对以乳腺癌细胞MCF-7为细胞模型建立方法，利用磁性纳米可靠诊断淋巴结转移癌进行详细说明。一、方法1、磁性纳米球(MNs)的制备磁性纳米球是通过层层组装法在苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球表面层层组装磁性纳米颗粒nano-γ-F2O3得到。具体步骤为：(1)采用无乳聚合法制备得到苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，并依次通过酰肼化、丁二酸酐化在纳米球表面修饰上羧基，得到表面带有羧基的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球(Pst-AAm-COOH)。(2)取1mL表面带有羧基的苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，依次向其中加入25mgEDC和15mgNHS活化(EDC和NHS分别用200μL0.01MpH7.2的PBS溶解)，然后将其加入到1mLPEI(MW：25K，溶于0.01MpH7.2的PBS，浓度：0.2g/mL)，于37℃摇床反应过夜，在纳米球表面组装一层PEI。(3)将步骤(2)所得产物用0.5MNaCl溶液离心洗涤4次(16000rpm×20min)，再依次用超纯水离心洗涤6次(除去未反应的PEI)、无水乙醇离心洗涤6次(12000rpm×15min)，然后用800μL正己醇超声分散均匀。与此同时，取400μL磁性纳米粒子nano-γ-F2O3用无水乙醇沉淀后也用800μL正己醇超声分散均匀，加入到纳米球中混合摇匀，置于摇床上室温反应2h。(4)将步骤(3)所得产物离心去上清，并用正己烷洗涤除去未组装上的磁性纳米粒子，然后分别用无水乙醇洗涤3次、超纯水洗涤1次，加入1.6mLPEI溶液(MW：750K，溶于0.01MpH7.2的PBS，浓度：10mg/mL)超声分散均匀置于摇床上室温反应2h，组装第二层PEI。(5)将步骤(4)所得产物离心去上清，用超纯水离心洗涤3次，除去未反应的PEI。重复步骤(3)、(4)进行多层组装，通过改变组装磁性纳米颗粒的层数，可以得到具有不同磁响应的磁性纳米球。6)将组装了5层磁性纳米粒子的纳米球用无水乙醇洗涤三次，分散于4mLPVP-k30溶液中(用无水乙醇配制，浓度：20mg/mL)，置于摇床上室温反应24h。(7)向步骤(6)所得产物中加入95μL氨水(29.8wt％)和125μLTEOS溶液(用无水乙醇配制，10vol％)，室温下继续摇床反应12h。(8)取步骤(7)所得产物约10μL，离心洗涤后分散于1mL超纯水中，用动态光散射仪测其zeta电势，当zeta电势变为-25mV左右时，继续下一步反应(若电势没有达到-25mV，则需再次加入TEOS溶液，继续反应，直到电势达标)。加入125μLAPTES溶液(用无水乙醇配制，10vol％)，继续在摇床上反应12h，测定样品的zeta电位，当zeta电位变为25mV左右时，即可终止反应(若电位没有达到25mV，则需再次加入APTES溶液，继续反应，直到电位达标)。(9)将步骤(8)所得产物用无水乙醇离心洗涤3次。然后可进行以下两种处理：a.用超纯水洗涤3次后，分散到1mL超纯水中，即得表面为氨基的功能纳米球，存放待用；b.将表面为氨基的功能纳米球分散到3mLDMF中，再加入1mL溶解0.08g丁二酸酐的DMF，置于摇床上，室温下反应3h，测定样品的zeta电位，当电位达到-30mV左右时即可终止反应，将样品用乙醇离心洗涤3次，超纯水离心洗涤3次，即得表面为羧基的功能纳米球(即磁性纳米球，粒径429nm)，分散于1mL超纯水中存放待用。2、抗体筛选上皮粘附分子(EpCAM)、广谱角蛋白(pan-CK)、E-钙粘蛋白均在癌细胞的细胞膜上有不同程度的表达，本实验以乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型，通过免疫荧光实验考察这三种抗原在MCF-7细胞细胞膜上的表达情况，筛选出在癌细胞膜上表达量高的抗原相应的抗体。具体实验过程为：(1)取上述抗原相应的抗体(均为小鼠来源)2μL(1:200稀释)加入到400μLMCF-7细胞悬液中(分散于0.5％的BSA，浓度1×105个/mL)，置于37℃培养箱中孵育30min，用1×PBS洗去未结合上的多余抗体(洗四次)。(2)将上述细胞重悬于400μL0.5％的BSA中，加入2μL染料标记的鼠源二抗(1:200稀释)，置于37℃培养箱孵育30min，用1×PBS洗去未结合上的多余二抗(洗五次)。(3)设计三组对照实验：a.将相同浓度的MCF-7细胞相同条件下直接和染料标记的二抗孵育；b.将相同浓度的MCF-7细胞加4％的多聚甲醛固定10min，加Triton-X100通透10min后按上述步骤(1)、(2)操作加一抗和二抗孵育；c.将相同浓度的MCF-7细胞加4％的多聚甲醛固定10min，加Triton-X100通透10min后仅加染料标记的二抗孵育。整个过程需在避光的条件下进行，然后在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光强度。3、磁性纳米球的生物功能化及表面抗体有效结合位点数目的定量利用EDC/NHS活化法将抗EpCAM抗体修饰到磁性纳米球表面。具体步骤为：(1)取大约100μL(29mg/mL)上述制备的磁性纳米球(MNs)，用0.01MpH6.8PBS洗涤两次后分散到200μL0.01MpH6.8的PBS中；(2)称取4mgEDC和2mgNHS各用100μL0.01MpH6.8PBS溶解，然后立即加入到前面分散有磁性纳米球的PBS中(先加EDC，后加NHS)；(3)室温下轻摇反应25min后，通过磁分离用0.01MpH7.2的PBS将磁性纳米球洗涤一次，然后分散到1mL0.01MpH7.2的PBS中，加入约20μL抗EpCAM抗体(1mg/mL)，反应4h以上；(4)用0.01MpH7.2PBS洗涤五次除去未反应的抗体，制得免疫磁球(IMNs)，存于4℃冰箱待用。以修饰了抗EpCAM抗体的免疫磁球(IMNs)为研究对象，计算该免疫磁球表面抗体的有效结合位点的数目。具体实验过程为：(1)首先测定一定量IMNs和染料标记的二抗充分结合后的荧光强度，具体为：取10μLIMNs和10μLFITC-mouseIgG(0.5mg/mL)混合在1×PBS中37℃摇床反应1h；然后用1×PBS洗涤8次以上，分散到400μL1×PBS中，测定其荧光强度，同时取一部分上述样品稀释5倍后，测定其在600nm处的吸光度，用于计算IMNs的浓度；(2)与此同时，将已知浓度的MNs按下列稀释比进行稀释：0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010，然后测定这些溶液在600nm处的吸光度并绘制吸光度-浓度标准曲线；(3)结合样品在该波长处的吸收值计算出免疫磁球的浓度；(4)最后，在与(1)中IMNs相同浓度的MNs存在下测定并绘制当FITC-mouseIgG稀释浓度为0、0.33、0.67、1.0、1.33、1.67μg/mL时荧光强度对其浓度的标准曲线，结合前面测得的样品的荧光强度，计算出每个免疫磁球(IMNs)上有效结合位点的数目。其中，由于组装法合成过程中球的损失很少，即可将组装前聚合物球的浓度作为MNs的浓度，组装前聚合物球的浓度采用密度法进行测定，由于一定的合成条件下不同批次的纳米球的粒径和密度都比较接近，通过下面的公式计算由公式1和2可以看出，密度项对纳米球浓度的测定结果影响较小。所以在相同的合成条件下，用动态光散射粒径仪测得Pst‐AAm球的水合粒径d，对于每批纳米球只需要通过烘干称重得到纳米球的质量体积浓度Cm/V，即可以通过密度法算出纳米球的准确个数质量浓度CN/m和个数体积浓度CN/V。CN/m＝0.001/[4/3π(d/2)3ρ]1CN/V＝0.001/[4/3π(d/2)3ρ]×Cm/V24、免疫磁球浓度及孵育时间对癌细胞捕获效率的影响首先确定IMNs的用量并评估其特异性：取0.10mg、0.19mg、0.29mg、0.38mg的IMNs分别加入1mLMCF-7细胞悬浮液中(MCF-7细胞分散于1mL1×PBS中，浓度为1.0×105/mL)，37℃条件下轻摇孵育20min，磁分选并用1×PBS洗涤3次以上，收集上清液和细胞磁球浊液并用血细胞计数板对其中的MCF-7细胞进行计数，计算捕获率。接下来研究不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率：将0.29mg的IMNs分别加入到5等份MCF-7细胞中(MCF-7细胞分散于1mL1×PBS中，浓度为1.0×105个/mL)，分别在37℃条件下轻摇孵育5min、10min、15min、20min、25min，分别收集上清液和细胞磁球浊液并用血细胞计数板对其中的MCF-7细胞进行计数，计算捕获率。接下来设计两个对照实验研究IMNs对癌细胞捕获的特异性，具体为：(1)将0.29mg的IMNs加入到1mLJurkatT细胞悬浮液中(JurkatT细胞分散于1mL1×PBS中，浓度为1.0×106个/mL)，在37℃条件下轻摇孵育20min。按照前面的步骤进行操作并计算捕获效率；(2)将未修饰抗体的MNs加入到上述MCF-7细胞悬浮液中(MCF-7细胞分散于1mL1×PBS中，浓度为1.0×105个/mL)。按照前面的步骤进行操作并计算捕获效率。其中，捕获率＝浊液中细胞个数/(浊液中细胞个数+清液中细胞个数)。5、IMNs对混合体系中低浓度的癌细胞的检测用IMNs捕获混合细胞体系中低浓度的肿瘤细胞。将不同量用Hoechst33342染核的MCF-7细胞分别加入JurkatT浓度为106个/mL的1×PBS溶液中，使MCF-7细胞的浓度约为5、50、100、500、1000个/mL。向以上体系中，加入一定量的IMNs，37℃下轻摇避光孵育20min，磁分选并洗涤，将清液和浊液分别收集于细胞培养皿中，通过荧光显微镜对其中的MCF-7细胞进行计数并计算捕获效率。6、对捕获癌细胞的免疫细胞化学鉴定将MCF-7细胞加入1×PBS、105个/mLJurkatT细胞悬液中，使MCF-7细胞的浓度约为103个/mL制得模拟临床穿刺细胞标本，向其中加入IMNs，37℃下轻摇孵育5min；磁分选并用1×PBS洗涤一次，加入4％多聚甲醛溶液重悬捕获的细胞并在37℃下孵育10min，将细胞固定；磁分选后加入0.1％Triton-X100溶液重悬细胞并在37℃下孵育10min，将细胞进行通透处理；磁分选后加入30μg/mLHoechst33342溶液重悬细胞，再加入FITC标记的抗CK19抗体、PE标记的抗CD45抗体，在37℃下避光孵育30min，进行免疫细胞化学染色；磁分选并用1×PBS洗涤5次，最后将细胞重悬于100μL1×PBS中并将其置于PDMS小室中，用磁铁将捕获的细胞吸引至小室底部，通过倒置荧光显微镜对细胞进行观察鉴定并计数。7、IMNs对病人淋巴结穿刺物中转移癌细胞的检测(1)反应条件的优化对于临床病理医生来说，细胞的形态学特征是做出病理诊断的参考要素之一，所以磁分选后使癌细胞保持良好的细胞形态显得尤为重要。而且从不同病人身上取得的癌细胞和培养的癌细胞形态和性质都有所差异，因此以实际转移癌病人的癌细胞标本为研究对象，考察孵育时间对癌细胞形态的影响，具体实验过程为：对转移癌病人肿大的淋巴结进行细针穿刺，将所得穿刺物分散于4mL1×PBS中，吹匀并均分成4等份；分别向上述标本悬液中加入一定量等量的IMNs，室温条件下分别轻摇孵育5min、10min、15min、20min，磁分选并用1×PBS洗涤2次；然后将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪吸取并滴加到载玻片划定区域内(1.5cm×1.5cm)，小心均匀铺展开来，将玻片用钨灯烘干后，用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。考虑到不同病人细胞标本之间本身就存在差异性，分别考察孵育时间对淋巴结转移癌的三种常见癌细胞：鳞癌、腺癌、未分化癌的细胞形态的影响。接下来考察不同干片方法对癌细胞形态的影响，具体实验过程为：对转移癌病人肿大的淋巴结进行细针穿刺，将所得穿刺物分散于4mL1×PBS中，吹匀并均分成4等份；分别向上述标本悬液中加入一定量等量的IMNs，室温条件下轻摇孵育10min，磁分选并用1×PBS洗涤2次；然后将浊液分散于10μL1×PBS中,用移液枪吸取并滴加到载玻片划定区域内，小心均匀铺展开来；将四张细胞涂片分别用自然风干、热风吹干、钨灯烤干和37℃烘箱烘干四种方法进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。同样考虑到不同病人细胞标本之间本身存在的差异性，分别考察不同干片方式对淋巴结转移癌的三种常见癌细胞：鳞癌、腺癌、未分化癌的细胞形态的影响。8、实际穿刺细胞标本中转移癌的检测和染色鉴定分别对转移性鳞癌和转移性腺癌病人肿大的淋巴结肿块进行细针穿刺，将所得穿刺物分散于1mL1×PBS中，吹匀加入20μLIMNs，室温条件下轻摇孵育10min，磁分选并用1×PBS洗涤2次，然后将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到载玻片疏水笔划定的区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将细胞涂片置于钨灯下进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。其中具体涂片及瑞氏染色步骤如下：1)将磁分选后的细胞和磁球滴加到玻片划定的区域内，用枪头均匀推开，将玻片放入37℃烘箱烘干或用钨灯烤干(约3min)；2)滴加0.5mL刘A试剂，使其均匀分散到涂片区域约一分钟；3)在刘A试剂上覆盖滴加1mL刘B试剂，使其均匀分散到涂片区域约一分钟；4)流水冲去刘A刘B试剂，即可在显微镜下观察。免疫细胞化学鉴定：将干片后的细胞涂片滴加200μL4％多聚甲醛溶液完全覆盖标本区域，室温固定10min；小心吸去标本区上的固定液，然后滴加200μL0.1％Triton-X100溶液完全覆盖标本区域，室温通透10min；小心吸去标本去的通透试剂，然后用200μL0.2％BSA洗涤标本区域2次，每次一分钟；吸弃标本区上的0.2％BSA，将配制好的抗体试液(将FITC标记的鼠二抗1:100稀释、PE标记的抗CD45抗体1:100稀释、Hoechst33342染料1:1000稀释分散于200μL0.2％BSA)加至标本区，室温避光孵育1h，为了防止标本区干片，使用湿盒并避光保存；最后使用0.2％BSA洗标本区5次以上，吸尽残留液体，直接在倒置荧光显微镜下观察。如要长期保存则盖上盖玻片，轻轻按压并吸去周围液体，置于2-8℃环境下避光保存。二、结果1、磁性纳米球的表征成功制备了组装5层磁性纳米粒子的MNs，通过透射电镜表征(图2a)可以看出，MMs粒径均一，从水合粒径柱状分布图(图2c)可以看出，MNs平均粒径约为429nm，与其电镜图相吻合，且具备良好的单分散性。通过测定放置12个月以后MNs的水合粒径(如图2d所示)，发现其粒径基本不变、单分散性良好，说明MNs的性质十分稳定，可以在室温下长期保存。测定组装5层磁性纳米粒子的MNs的磁响应速率，通过计算用磁力(Invitrogen，12320D，磁力架表面的磁场强度为325±25mT)吸引不同时间下MNs的捕获效率来评价其磁响应速率：将MNs悬液置于磁力架上，吸引不同的时间(0s、30s、60s、90s、120s、180s)后将清液取出，测定MNs原液和清液在600nm处的吸收值。研究已证明MNs悬液在600nm处的吸收值正比于其浓度，所以可以通过以下公式计算出不同时刻下MNs的捕获效率φt＝(1-At/A0)×100％3其中，At为用磁力架吸引MNs不同时间后所得清液在600nm处的吸收值，A0为MNs原液在600nm处的吸收值。由图2b可以看出，随着磁力架吸引时间的增长，MNs越来越多的被吸引过来，1min就有90％以上的MNs被吸引，可见其磁响应速度极快。2、抗体筛选淋巴结转移癌多为上皮来源的恶性肿瘤细胞，因此需构建一种对上皮来源癌细胞有较高捕获效率且高特异性的免疫磁球。以人乳腺癌MCF-7细胞为细胞模型，考察广谱的角蛋白(pan-CK)、E型钙粘蛋白(E-Cad)以及上皮粘附分子(EpCAM)三种癌细胞膜蛋白的表达水平，通过图3所示的免疫荧光实验，即一抗和癌细胞膜上的相应抗原结合，然后一抗再特异性结合染料标记的二抗，由二抗所标记染料的荧光强度即可推测癌细胞膜上相应抗原的表达情况。由实验结果(图3a)可以看出，三种上皮性肿瘤标志物中只有EpCAM在MCF-7细胞膜上有较高的表达，而pCK和E-Cad呈低表达或不表达。接着考察了EpCMA在上皮性肿瘤细胞MCF-7和两种间叶性细胞JurkatT、LM9膜上的表达情况，由图3b可以看出EpCAM在肝癌LM9细胞和淋巴细胞JurkatT两种间叶细胞的细胞膜上呈不表达或低表达，证明了选抗EpCAM抗体作为淋巴结转移癌细胞的捕获抗体具有较高的特异性。基于此后续通过EDC/NHS活化法将抗EpCAM抗体修饰到MNs表面，构建对淋巴结转移癌细胞有高特异性和高捕获效率的免疫磁性纳米微球(IMNs)。3、IMNs表面抗体有效结合位点数目的定量免疫磁球表面抗体的有效结合位点数目作为评价磁球性能的一个重要参数，对理论上考察和探索磁球浓度与捕获效率的关系可提供重要参考。利用免疫磁球表面修饰的一抗和染料标记的二抗特异性结合的原理，测定IMNs表面抗体的有效结合位点数目。从实验结果来看：如图4(a)所示，测得MNs在600nm吸光度对其浓度的标准曲线，和一定量IMNs在600nm处的吸光度，即可计算得到IMNs的个数体积浓度为2.71×1011个/mL(MNs取苯乙烯-丙烯酰胺聚合物球的个数体积浓度1.65×1012个/mL)。如图4(b)所示，通过测定FITC-labeledmouseIgG稀释浓度分别为0、0.33、0.67、1.0、1.33、1.67μg/mL(加入与IMNs等量的MNs以扣除磁球的影响)时荧光强度对其浓度的标准曲线，同样条件下再测定IMNs和FITC-labeledmouseIgG(0.5mg/mL)孵育后的荧光强度，两者进行对照即可计算出IMNs上结合二抗的浓度，再根据前面所计算的IMNs的个数体积浓度，计算得到40μLIMNs表面二抗浓度为0.692μg/mL，查得鼠IgG的分子量约为150KD，计算IMNs表面活性位点数目N＝NIMNs/NIgG＝102。4、IMNs对乳腺癌MCF-7细胞的捕获能力EpCAM表达于上皮组织来源细胞的细胞膜上，在很多上皮癌组织中表达水平明显升高。而淋巴结的正常细胞源于间叶组织，不表达EpCAM，所以可以用偶联了抗EpCAM抗体的IMNs特异性捕获淋巴结转移癌细胞。为了保证IMNs可以高效地捕获目标细胞，需要优化IMNs的用量，研究IMNs在不同浓度下对MCF-7细胞细胞的捕获能力。由图5(a)可以看出，当IMNs的浓度≥0.29mg/mL时，捕获效率均达到95％以上。检测时间一直以来都是评价检测方法的重要指标，因此又研究了不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞(105个/mL)的捕获效率。由图5(b)可以看出，孵育5min，捕获效率就达到了90％，而随着孵育时间的延长，捕获效率并没有明显的增大，这说明IMNs与肿瘤细胞的结合速度非常快，且对肿瘤细胞有很强的捕获能力。这是由于IMNs粒径较小，在反应中具有很高的灵活性和很快的反应动力学特征。通过计算IMNs对MCF-7细胞、IMNs对JurkatT细胞以及MNs对MCF-7细胞的捕获效率，由图5(c)可以看出，IMNs对肿瘤细胞捕获特异性高、非特异性吸附小。5、IMNs对混合体系中低浓度的癌细胞的捕获细针穿刺作为目前临床诊断淋巴结转移癌常用的一种取材方法，由于简便快捷和创伤小等优势而易于被广大患者接受。然而由于细针取材常常只能是一个点或者一条线，所以穿刺样品中的转移癌细胞可能少之又少，这也是造成穿刺细胞学诊断准确度过低的重要原因。对穿刺样品中低少数癌细胞的富集无疑是提高淋巴结穿刺诊断转移癌准确率的关键所在。所以考察了IMNs对混合细胞体系中低浓度癌细胞的捕获能力，由图6(a)可以看出，IMNs对混合体系(MCF-7细胞0～1000个/mL、JurkatT细胞1×105个/mL)中低浓度(5、50、100、500、1000个/mL)的MCF-7细胞均有92％以上的捕获效率，而对JurkatT细胞的非特异性吸附作用较小(5％以下)，证明了IMNs对混合细胞体系中少量的癌细胞良好的捕获效果。通过磁分选前后混合细胞体系的免疫细胞化学鉴定结果(图6(b)和(c))，可以直观的看出磁分选良好的分离效果，再一次证明了将IMNs应用于复杂体系中少数癌细胞的检测可靠度高，对提高淋巴结穿刺诊断转移癌的准确度意义重大。6、免疫细胞化学鉴定免疫细胞化学(ICC)根据抗原与抗体特异性结合的特点，先用未标记的具有特异性的第一抗体与相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合。其中Hoechst33342核染料染细胞核，FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体阳性为MCF-7细胞，藻红蛋白(PE)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体阳性为JurkatT细胞。所以Hoechst33342(+)CK(+)CD45(-)鉴定为MCF-7细胞，而Hoechst33342(+)CK(-)CD45(+)鉴定为JurkatT细胞。由图7可以看出，IMNs成功分离出混合细胞体系中的肿瘤细胞，且特异性好、捕获效率高。7、IMNs用于实际病例癌细胞捕获条件的优化癌细胞保持完整的形态特征是细胞学诊断准确性的一大保证，在优化了免疫磁球用量以后，首先考察了不同孵育时间对癌细胞形态的影响，由图8a可以发现，当孵育时间在15min以内时，癌细胞均可保持良好的形态。图8b中显示了三种常见淋巴结转移癌：鳞癌、腺癌和未分化癌在不同孵育时间后的细胞状态，可以看出鳞癌和腺癌孵育15min仍能保持良好的状态，而未分化癌在孵育15min时，已经有溶胀现象。通过考察淋巴结常见的不同类型转移癌细胞在不同孵育时间内，其形态学特征的保持程度，可以确定孵育时间为5～10min时，对癌细胞的形态是几乎没有任何破坏的，所以可以根据实际情况选择合适的孵育时间达到快速诊断和准确诊断的目的。目前细胞学检查中常用的细胞涂片的干片方法是钨灯烤干，采取自然风干、热风吹干、钨灯烤干和37℃烘箱烘干四种方法对同一病人细胞涂片进行干片处理，然后用瑞氏染色试剂对细胞涂片进行染色并在显微镜下观察。由图9a-1～4可以看出，钨灯烤干(约3min)和37℃烘箱烘干(约5min)两种干片方法均能达到良好的干片效果且很好的保持了癌细胞的形态，自然风干(约10min)的方法耗时长且细胞容易退变，吹风机热风吹干(约2min)的方法虽然耗时短但是对细胞伤害较大，染色效果不佳。同样对淋巴结转移性鳞癌、腺癌和未分化癌细胞分别做了实验考察，图9b所示为不同干片方法下三种常见的淋巴结转移癌：鳞癌、腺癌和未分化癌癌细胞的状态。可以看出钨灯烤干的三种癌细胞均能保持良好的形态，而只未分化癌细胞在37℃烘箱烘干时会有轻微溶胀现象，所以可以根据实际情况合理选择两种干片方法。综上所述，本实施例优化了对转移癌病人穿刺物中癌细胞检测的实验条件，使操作流程化，且可靠度高、重现性好。如图10所示，具体操作过程为：(1)对转移癌病人肿大的淋巴结进行细针穿刺，将所得穿刺物分散于1mL1×PBS中；(2)吹匀加入20μLIMNs，室温条件下轻摇孵育10min，磁分选并用1×PBS洗涤2次；(3)涂片和干片。将浊液分散于10μL1×PBS中，用移液枪滴加到载玻片划定区域内(1.5cm×1.5cm)，并均匀铺展开来，将玻片放在钨灯下烤干(约2min)；(4)瑞氏染色：滴加0.5mL刘A试剂，使其均匀分散到涂片区域约一分钟，在刘A试剂上覆盖滴加1mL刘B试剂，使其均匀分散到涂片区域约一分钟；(5)用流水冲去刘A刘B试剂，即可在显微镜下观察。8、免疫磁分选方法于细胞学诊断的优势将等量的IMNs和MNs加入到同一转移癌病人的两份淋巴结穿刺物的悬液中，相同条件下进行磁分选实验。由图11(a)可以看出，IMNs富集到了大量具有异型性的癌细胞，而MNs磁分选之后镜下仅见磁球，未见非特异性吸附过来的细胞。表明此方法对癌细胞的检测具有较高的特异性。对比同一病人穿刺细胞的直接涂片和磁分选之后的涂片结果，如图11(b)所示，直接涂片镜下背景杂乱，且细胞种类多样，可见红细胞(绿色箭头所指)、上皮细胞(红色箭头所指)以及间叶纤维细胞(黑色箭头所指)。而磁分选后的细胞涂片，IMNs捕获了大部分的上皮细胞，且镜下视野清晰，细胞形态一目了然。考虑到发生淋巴结转移的癌细胞大多为异型性上皮细胞，所以磁分选的方法无疑将成为淋巴结转移癌诊断行之有效的一种手段。研究发现免疫磁分选后癌细胞仍保留其特定的形态特征，与病理学判据相吻合。如转移性鳞状细胞癌(恶性程度很高，很早出现区域性淋巴结转移，但很少血源转移，预后较差)，其典型形态特征为细胞多形性明显，胞浆丰富，嗜酸性，无明显核仁，成堆排列。再如转移性腺癌，其典型形态特征为细胞呈柱状、卵圆形，核仁小而明显，胞浆可呈泡沫状，细胞可排列成腺泡状、管状和乳头结构，分泌粘液形成粘液细胞或滤泡。分别对转移性鳞癌和腺癌病人穿刺物进行免疫磁分选并涂片、染色观察，如图12(a-1，a-2)所示，细胞多形、胞浆丰富，为典型的鳞癌特征；而图12(a-3，a-4)所示细胞排列成腺泡状或乳头状，且见分泌滤泡，为典型腺癌特征。由此可见，免疫磁分选过程对转移癌穿刺细胞的外环境影响极小，保留了癌细胞的一些病理特征，为后续的形态学分析提供了可能性。此外，由于IMNs对上皮来源细胞的特异性捕获，用此方法区分诊断了淋巴结转移癌和恶性淋巴瘤(一种淋巴细胞变异的恶性肿瘤)以及淋巴结炎等良性病变，对难以确诊是转移癌还是恶性淋巴瘤的病人穿刺物进行免疫磁分选，结果如图12(b)所示，左图为直接涂片效果，仅从细胞形态也不排除为淋巴瘤，如要确诊还需要对其细胞进行免疫组化鉴定。右图为用修饰了抗EpCAM抗体的免疫磁球(IMNs)对其进行癌细胞收集，捕获了大量的上皮性细胞，故确定其为转移癌。证明了免疫磁分选对区分诊断转移癌和淋巴结的其他病变有很大的优势和应用前景。9、实际病人穿刺物中转移癌细胞的染色鉴定及结果分析为了证明磁分选得到的细胞为转移癌细胞，分别对转移性鳞癌和转移性腺癌病人的穿刺细胞磁分选并进行免疫细胞化学鉴定，其中Hoechst33342核染料染细胞核，FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体阳性为转移癌细胞，藻红蛋白(PE)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体阳性为淋巴细胞细胞。所以Hoechst33342(+)CK(+)CD45(-)鉴定为转移癌细胞，而Hoechst33342(+)CK(-)CD45(+)鉴定为淋巴细胞。由图13可以看出，ICC鉴定和瑞氏染色结果具有一致性，分别对转移性鳞癌、腺癌和未分化癌三种常见淋巴结转移癌做出准确诊断，表明该方法有较高的准确性。国际上通用的判断医学诊断方法是否可靠常用可靠性(reliability)即准确性(accuracy)，是由敏感度、特异度、假阳性率和假阴性率组成的总和概念。其中敏感度(sensitivity)指细胞学诊断为阳性和可疑的机率，实际上它代表的是真正的阳性率，反映了细胞学诊断正确判断的机率；特异度(specificity)指细胞学正确诊断为无病的机率，即真正的阴性率；假阳性率(falsepositiverate)指那些实际上无病，而细胞学诊断错误地判定为有病的机率，也称为误诊率，与特异度呈反比；假阴性率(falsenegetiverate)指那些实际上有病而细胞学错误地判定为无病的机率，也称为漏诊率，它与敏感度呈反比；总诊断准确率(overalldiagnosticaccuracy)指细胞学诊断去掉假阳性和假阴性后，真正的阳性和阴性病例在整个被检人群中的百分比，即人们常用的“符合率”。它代表该诊断方法对全体标本真正的判断能力。各个评价参数的具体统计计算方法如公式4～8所示：其中，TP为真阳性病例，TN为真阴性病例，FP为假阳性病例，FN为假阴性病例。对110例进行淋巴结转移癌检测的病人的穿刺样品进行了免疫磁分选检测，其中鳞癌43例，腺癌56例，未分化癌3例，淋巴结良性病变8例。并结合其活检免疫组织化学诊断结果进行了回顾性分析，发现假阴性结果2例，假阳性结果0例，真阴性结果8例，真阳性结果101例，按照公式4～8统计计算结果如下表1所示。表1.免疫磁分选诊断淋巴结转移癌对比于传统细胞学的诊断结果敏感度特异度假阳性率假阴性率总诊断准确率细胞学92.6％98.4％7.4％1.6％95.7％免疫磁分选98.1％100％0％1.9％99.1％