技术领域本发明涉及一种微生物诱变育种的方法，特别涉及一种利用脉冲电场诱变微生物的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
微生物菌种是发酵工业的基础和关键，因此微生物育种工作的开展十分重要。诱变育种不仅可以用于提高代谢产物的产量，而且可以用来改善产品质量、扩大品种以及简化工艺，具有简便易行、收效显著、成本低、诱变方式多等优点。根据诱变剂的不同可将诱变育种划分为物理诱变、化学诱变和生物诱变。大多数的化学诱变剂都是致癌物质或剧毒药品，对人体和环境具有潜在危害；生物诱变剂应用面偏窄，不能广泛用于菌种选育；物理诱变方法设备简单、操作方便、安全性高且诱变效果好，是目前工业微生物育种最为常用的诱变手段。但是，长期、重复使用某种诱变源，往往导致突变率低、突变谱窄和抗性饱和。因此，需要开发新型、高效的诱变方法。目前，脉冲电场主要用于杀菌(如连续食品灭菌CN200910096711.2、荔汁液非热杀菌CN201410752465.2、针对单增李氏特菌CN201410421710.1等)、活性物质提取(如葡萄皮渣多酚CN201310140746.8、多糖CN201310569144.4、人参皂苷CN201410639581.3)和米糠油提取(如CN201410289492.0)及钝酶(如申请人取得的高压脉冲电场处理糙米稳定米糠的方法”ZL200810122654.6和“微波、紫外线和高压脉冲电场联合处理糙米稳定米糠的方法”(ZL200810122657.X)等方面。脉冲电场(pulsedelectricfield，PEF)技术是一项冷加工技术，是对置于处理室中的物料反复施加电脉冲的过程。PEF处理会诱导细胞膜电击穿，因此PEF技术被作为一种物理灭菌手段用于食品杀菌领域，具有低温、操作简便、无毒性及杀灭效果好等优点。将脉冲电场用于微生物诱变育种是一个崭新的技术，目前还没有相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述问题，提供一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，采用脉冲电场诱变微生物的方法，是以脉冲电场作用于待诱变微生物，得到突变微生物。本发明的目的是这样实现的，一种利用脉冲电场进行微生物育种的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)样品的制备将菌体活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓度，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得102-103CFU/mL的菌悬液，取100μL涂布固体培养基，培养至对数生长期后期，制得单菌落；(2)诱变操作1)设置空调温度为25℃，调节室温；2)将脉冲电场下极板用75％酒精擦拭，这里的下极板即为载物台；3)将步骤1制得的单菌落放在载物台中央，调节上极板使极板间距为4mm；4)设置脉冲宽度0-50μs、脉冲电场电压为0-5kV、频率为100-1000Hz；5)对样品进行电场处理，诱变时间为0-120s；(3)诱变条件优选将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌液体培养基的试管中，涡旋使菌体分散、混匀，培养至稳定期后期，测量发酵液中目标产物的含量，以未经电场处理的原始菌株做对照试验，根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电压、脉冲频率和处理时间；(4)诱变菌的分离和筛选采用步骤(3)优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤(2)诱变处理单菌落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到103CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，培养至稳定期，随机挑取单菌落于装有10mL灭菌液体培养基的试管中培养，获得突变菌株种子菌液，再将种子菌液接种于发酵培养基中培养进行发酵培养，测量发酵液中发酵产物的含量，根据所测得的目标产物的产量或质量确定目的菌株。使用脉冲电源进行诱变，该诱变条件为：(1)采用均强脉冲电场，一般操作设置电压0-5kV控制电场强度为0-15kV/cm、脉冲频率100-1000Hz、脉冲宽度0-50μs、处理时间为0-120s、构成脉冲电场的平行极板间距为0-10cm可调，这里的平行极板包括上极板、下极板；(2)温度为室温，可以通过调节室内温度调节处理温度；(3)诱变样品为菌龄为对数生长后期的单菌落。所述步骤(1)中，用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得102-103CFU/mL的菌悬液，优选5×102CFU/mL的菌悬液。在本发明中下极板即为本发明中的载物台，主要用于放置受处理对象；平行极板包括上下极板，为高压脉冲电场的装置，同时下极板为载物台；优选5×102CFU/mL的菌悬液的目的主要有两个方面：(1)保证充足的单菌落作为处理对象；(2)保证单菌落在培养皿上充分分散的，以减少单菌落之间的粘连情况。本发明方法先进科学，通过本发明，在用所述脉冲电场诱变微生物时，处理温度为室温，可以通过调节室内温度调节处理温度。待诱变微生物为固体培养基上的单菌落。所施加的脉冲电场诱变剂量可以通过固定极板间距后调节电压(0-5kV)控制电场强度为0-15kV/cm、脉冲频率(100-1000Hz)、脉冲宽度(0-50μs)处理时间(0-120s)调节。所述诱变微生物为细菌，具体可为戊糖片球菌。本发明所述脉冲电场诱变微生物的方法具有以下优点：得到的正向突变菌株生产目标产物的能力更强，其产量可提高2.5倍；遗传稳定性好，经15代传代后产量稳定；处理后的微生物不需要避光培养，简化实验操作；具有操作简单、安全、无污染、设备和实验成本低的特点，将在工业微生物诱变育种领域发挥更大的作用。通过本发明，功能：优化脉冲电场诱变微生物的方法，得到高产、稳定的乳酸菌菌株；效果：弥补国内脉冲电场在微生物育种方面的空白，为后期的菌株选育提供可靠的方法。脉冲电场装置成本小、效果好，育种的可行性也为其在菌种诱变方面提供新的途径，其普及速度非常快，也必将受到中小型企业的青睐。通过对已有微生物菌种的改良(育种)，就目前效果而言，至少可提高菌种使用效率200％以上。附图说明图1为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(nc.008525.1)的生长曲线。图2为脉冲电压对片球菌素抑菌活性的影响。图3为脉冲电场处理时间对片球菌素抑菌活性的影响。图4为脉冲频率对片球菌素抑菌活性的影响。图5为传代培养戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P7的抑菌活性。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。使用脉冲电源进行诱变。该诱变条件为：1、采用均强脉冲电场，一般操作设置电压0-5kV控制电场强度为0-15kV/cm、脉冲频率100-1000Hz、脉冲宽度0-50μs、处理时间为0-120s、构成脉冲电场的平行极板间距为0-10cm可调。2、温度为室温，可以通过调节室内温度调节处理温度。3、诱变样品为菌龄为对数生长后期的单菌落。利用脉冲电场诱变的具体实验步骤如下：1、样品的制备将菌体活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓度。用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得102-103CFU/mL的菌悬液，优选5×102CFU/mL的菌悬液，取100μL涂布固体培养基，培养至对数生长期后期，制得单菌落。2、诱变操作1)设置空调温度为25℃，调节室温；2)将脉冲电场下极板(载物台)用75％酒精擦拭；3)将步骤1制得的单菌落放在载台中央，调节上极板使极板间距为4mm；4)设置脉冲宽度0-50μs、脉冲电场电压为0-5kV、频率为100-1000Hz；5)对样品进行电场处理，诱变时间为0-120s。3、诱变条件优选将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌液体培养基的试管中，涡旋使菌体分散、混匀，培养至稳定期后期，测量发酵液中目标产物的含量，以未经电场处理的原始菌株做对照试验。根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电压、脉冲频率和处理时间。4、诱变菌的分离和筛选采用步骤3优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤2诱变处理单菌落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到103CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，培养至稳定期，随机挑取单菌落于装有10mL灭菌液体培养基的试管中培养，获得突变菌株种子菌液，再将种子菌液接种于发酵培养基中培养进行发酵培养。测量发酵液中发酵产物的含量，根据所测得的目标产物的产量或质量确定目的菌株。下面结合具体的实施例来进一步说明本诱变方法：实例：利用脉冲电场诱变戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(nc.008525.1)。一、脉冲电场诱变戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(nc.008525.1)。本实验中所用培养基组成如下：MRS液体培养基：每升培养基中含有10.0g牛肉膏，4.0g酵母粉，10.0g蛋白胨，2.0g柠檬酸三铵，20.0g葡萄糖，5.0g乙酸钠，0.2g七水硫酸镁，0.05g硫酸锰，1.08g吐温-80，2.0g磷酸氢二钾。所述MRS培养基pH为6.0。121℃高压灭菌15min。BHI液体培养基：每升培养基中含有200.0g牛脑，250.0g牛心浸出汁，10.0g蛋白胨，2.0g葡萄糖，5.0g氯化钠。所述BHI培养基pH为7.0。121℃高压灭菌15min。固体培养基是在每升上述液体培养基中加15g琼脂，半固体培养基是在每升上述液体培养基中加10g琼脂。具体实验步骤如下：1、样品的制备以戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(nc.008525.1)为出发菌株。将活化后的戊糖片球菌(nc.008525.1)以1％(v/v)的接种量接种于数支装有10mLMRS液体培养基的试管中，37℃培养，48h内每隔2h取样，测OD600。以发酵时间为横坐标、OD600值为纵坐标绘制生长曲线。由图1可知，糖片球菌(nc.008525.1)在此条件下培养，延滞期较短(0-3h)，进入对数生长期(3-14h)后，菌浓度快速增高；15h后进入稳定生长期，菌浓度基本保持不变。将戊糖片球菌(nc.008525.1)活化后，采用0.85％生理盐水十倍梯度稀释、平板计数法获得菌液浓度为6.6×108CFU/mL。用0.85％生理盐水适当稀释菌液获得5×102CFU/mL的菌悬液，取100μL涂布固体培养基，培养至15h，制得单菌落。2、诱变操作1)设置空调温度为25℃，调节室温；2)将脉冲电场下极板(载物台)用75％酒精擦拭；3)将步骤1制得的单菌落放在载台中央，调节上极板使极板间距为4mm、脉冲宽度10μs；4)设置脉冲电场电压为0-5kV、频率为100-1000Hz；5)对样品进行电场处理，诱变时间为0-120s。按照上述方法，每次处理单菌落一个。3、诱变条件优选将经诱变处理后的单菌落置于装有10mL灭菌MRS液体培养基的试管中，涡旋使菌体分散、混匀，37℃静置培养32h。4000r/min4℃离心20min，取上清，用2mol/LNaOH在磁力搅拌、冰浴条件下调pH4.5，过0.22μm聚砜滤膜除菌，琼脂扩散法检测抑菌活性。以未经电场处理的原始菌株做对照试验。根据实验结果确定适宜的脉冲电场诱变电压、频率和处理时间。如图2所示，当电压为0.8-1kV时，抑菌活性显著提高，当电压为1kV时，抑菌圈直径达到最大值17.73mm。电压在1-2kV时，抑菌圈直径减小但不显著。电压在2-5kV范围内，抑菌圈直径随电压的增大显著减小。因此，选择最佳电场电压为1kV。由图3可知，当处理时间为20s时，抑菌圈直径为16.00mm，抑菌活性与处理前几乎相同，即此条件下电场对菌株几乎不产生影响。处理时间在40-80s时，抑菌活性不断提高，当处理时间为80s时，抑菌圈直径达到最大值18.37mm。之后随处理时间的继续增加，抑菌活性呈现显著下降趋势，且抑菌圈直径小于处理前(16.10mm)。选择80s为最适处理时间。由图4可知，当电场频率为100-300Hz时，抑菌圈直径显著小于处理前(16.10mm)，即该阶段电场对片球菌素产生的负面影响较大，且方差分析结果显示该阶段电场频率的变化对片球菌素合成的影响不显著(P<0.05)。当电场频率为300-700Hz时，抑菌圈直径显著提高，当电场频率为700Hz时，抑菌圈直径达到21.30mm。之后，当电场频率为700-1000Hz时，抑菌活性显著下降，但抑菌圈直径仍高于处理前(16.10mm)。因此，选择700Hz为最适电场频率。确定该脉冲电场诱变戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(nc.008525.1)的适宜诱变剂量为：脉冲电场电压为1kV、脉冲频率为700Hz以及处理时间为80s。4、诱变菌的分离和筛选采用步骤3优选所得脉冲电场诱变条件，按照步骤2诱变处理单菌落，将诱变后的单菌落分散于10mL灭菌生理盐水中，并适当稀释得到103CFU/mL菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布于固体培养基上，37℃培养24h，随机挑取单菌落于装有10mL灭菌MRS液体培养基的试管中，37℃培养24h获得突变菌株种子菌液，再将种子菌液按接种量3％接种于MRS液体培养基中，37℃进行发酵培养24h。离心取上清，调pH至4.5。通过琼脂扩散法检测发酵上清液的抑菌活性来验证是否是诱变的目的菌株，以未经电场处理、其他处理条件相同的原始菌株做对照试验。结果得到一株抑菌效价为102.68IU/mL的菌株，该正向突变菌株编号为P7。5、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P7的遗传稳定性检测将筛选出来的戊糖片球菌素高产菌株于斜面培养基上连续传代15代，每代挑取一环单菌落接入液体培养基中培养，采用琼脂扩散法分别测定各代菌株发酵上清液的抑菌活性，确定筛选出的高产戊糖片球菌素菌株的遗传稳定性。结果如图5所示。结果表明，在传代培养的1-15代中，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P7所产生的片球菌素效价保持在102.6-103IU/mL的稳定范围内。