技术领域本发明属于固定化酶的技术领域，具体涉及一种固定β-葡萄糖苷酶的方法及应用。
背景技术：
研究发现，在人体内，醣苷型的异黄酮不能直接被吸收，而是经小肠中细菌产生的β-葡萄糖苷酶水解去醣基后进入血液，才能发挥各种生理作用(Izumietal.,2000;Takahashietal.,2005)。而人体小肠中的菌群由于个体差异会有很大差异，所以如果直接摄入不带醣基的苷元型异黄酮，则可以有效提高其利用效率(Tsangalis,Ashton,Stojanovska,Wilcox,&Shah,2004)。微生物生产的β-葡萄糖苷酶是目前主要应用于大豆异黄酮去醣基的酶，然而酶成本较高，反应过程中易失活，且不能被回收利用，因此应用上有其局限性。所以，若将酶固定到化学性质稳定的不溶性载体上，则可以有效解决上述问题(Dervakos&Webb,1991)。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对现有技术中存在的问题，提供一种用纤维素载体固定β-葡萄糖苷酶的方法，用于黑豆浆中大豆异黄酮醣去醣基作用，以期建立可用于稳定、高效生产具有高生理活性黑豆浆的反应系统。所述用纤维素载体固定β-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：（a）纤维素载体的合成与修饰：①取6.25g市售纤维素粉末溶于50ml丙酮与DMSO组成的有机溶剂中，所述丙酮与DMSO的体积比为3:2，将所得溶液用针筒逐滴滴入冷水中，形成纤维素颗粒并将其置于室温下干燥待用；②量取体积大约为40cm3所述纤维素颗粒置于100ml浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，在40℃条件下加热90min，以增加其表面之羟基数目。（b）纤维素载体与酶的共价结合：③将经上述步骤加热处理过的40cm3纤维素载体置于50ml加热至100℃的3%（v/v）的戊二醛水溶液中1h后，在室温下用蒸馏水冲洗；④将β-葡萄糖苷酶溶于浓度为0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液中形成浓度为1mg/ml的酶溶液，并与所述经步骤③处理的纤维素载体在4℃条件下混合静置16h；⑤用纱布将酶溶液滤去并保留滤液待测，用0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液冲洗纤维素载体，在4℃条件下储存，得到所述固定化酶。所述固定化酶含量测定：①将1mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液序列稀释，分别加入10μl与200μl浓度为10%的染色剂Coomassieblue，30min后测定其在595nm的吸光值，绘制标准曲线。②在制备固定化酶所得的滤液中加入10μl浓度为10%的染色剂Coomassieblue，30min后测定其在595nm的吸光值，根据标准曲线方程得出滤液中残留的蛋白含量，从而得到固定于载体上的酶含量。所述固定化酶最适作用温度及酶活动力学测定：在pH为6的磷酸缓冲液中加入5mgp-NPG，依次以所述固定化酶在30、40、50、60和70℃，100rpm条件下反应1h。取反应后的底物900μl加入到1ml浓度为1MNa2CO3溶液中，在425nm条件下测定其OD值。配置浓度为0.1-20mmol/L的p-NPG溶液作为底物，分别用固定化酵素在其最适反应温度下作用5min后，取900μl加入到1ml浓度为1M的NaCO3溶液中，在425nm条件下测定其OD值并根据标准曲线算出产物浓度，根据公式V=Vmax[S]/(Km+[S])得到酵素动力学常数Km值，并与游离酶的结果做比较。本发明以纤维素为载体固定化酶，应用于我国传统具有高营养价值的黑豆浆中的异黄酮的去醣基化，形成具有高生理活性的游离态的苷元。利用固定化酶技术在黑豆浆的加工过程中实现酶的重复利用以及方便产物的分离，在生产应用中具有极高的经济效应；同时，将大多数农业废弃物的主要成分纤维素开发成为固定化酶的载体亦符合当今环境发展的需求。附图说明图1为本发明实施例1固定β-葡萄糖苷酶前后纤维素载体的ESCA结果，图中A-1和A-2分别是以碳原子为基准，固化测试前后的对比；B-1和B-2分别是以氮原子为基准，固化前后的测试对比；图2为本发明实施例1固定β-葡萄糖苷酶前后纤维素载体的表面微观结构；图3为在不同作用温度下本发明实施例1固定化酶与游离酶的相对活性对比；图4和图5为采用本发明实施例1的固定化酶处理后黑豆浆中四种异黄酮含量变化趋势。具体实施方式以下结合附图对本发明作进一步说明。实施例1固定化酶的制备：①取6.25g市售纤维素粉末溶于50ml丙酮与DMSO组成的有机溶剂中，所述丙酮与DMSO的体积比为3:2，将所得溶液用针筒逐滴滴入冷水中，形成纤维素颗粒并将其置于室温下干燥待用；②量取体积大约为40cm3所述纤维素颗粒置于100ml浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，在40℃条件下加热90min，以增加其表面之羟基数目，得到所述纤维素载体；③将所述40cm3纤维素载体置于50ml加热至100℃的3%的戊二醛水溶液中1h后，在室温下用蒸馏水冲洗；④将β-葡萄糖苷酶溶于浓度为0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液中形成浓度为1mg/ml的酶溶液，并与所述经上述步骤处理的纤维素载体在4℃条件下混合静置16h；⑤用纱布将酶溶液滤去并保留滤液待测，用0.1mol/L、pH6的磷酸缓冲液冲洗纤维素载体，在4℃条件下储存，得到所述固定化酶。测定不同浓度的β-葡萄糖苷酶水溶液（由1000μg/ml对被稀释五次至31.25μg/ml）在波长为595nm处的吸光值，并据此作图，计算出线性函数方程式。该标准曲线的标准偏差R2为0.9916，其吸光值对应浓度方程式为Abs(c)=0.0004(c)+0.2838。图1为实施例1中纤维素载体固定化β-葡萄糖苷酶前后ESCA分析结果，可以验证固定化β-葡萄糖苷酶前后，纤维素载体表面的键结变化情况。A、B分别为以C、N元素为基准的电子能谱图。A-1、B-1为未处理纤维素表面键结。纤维素经NaOH修饰处理后表面羟基数目增加，并与戊二醛发生缩醛反应。图A-1中284.6及287.35eV处出现的尖峰分别表示C—H和C=O键结；图B-1中无尖峰出现，这是因为未处理的纤维素中不含N元素。A-2、B-2为分别以C和N元素为基准的固定化酶之后纤维素表面电子能谱图。A-2与A-1相比，可以发现285.8eV处新增加了表示—C=N—键结的尖峰，在287.35eV处的峰值降低；B-2与B-1相比可发现在399.8处新增了表示—C=N—官能基的尖峰。综上可得，酶蛋白分子的游离氨基端通过戊二醛的作用连接到了纤维素载体表面的游离OH基上，并与纤维素分子形成交联结构。图2为上述实施例1中纤维素载体固定化酶前后表面微观结构的变化情形。其中，C1、C2为处理前纤维素载体在不同倍率下的扫描电镜检测结果；由图可知，该纤维素载体直径约为1.5mm，在高倍率检测下其表面均匀光滑。在相同条件下测得固定化β-葡萄糖苷酶后的纤维素载体，为D1、D2，可以发现其表面同样布满了蛋白颗粒，将其放大10000倍，可清晰观察到其蛋白分子的颗粒。实施例2固定化酶的活性测定：不同作用温度会影响酶的活性，且与其固定化的材料、方法密切相关。固定化酶与其游离酶相比，在不同温度下的相对酶活性会发生改变。可能的原因是载体改变了反应过程中的传质速率，以及在高温下载体上会有用于修饰的化学物质释出，影响酶活性。用p-NPG作为反应底物，通过测定相同反应时间后的产物对硝基苯酚的量以表示该条件下的酶相对活性。首先测定不同浓度（1mmol/L的对硝基苯酚对被稀释5次）的对硝基苯酚在1mol/LNaCO3环境下OD425nm处的吸光值，并据此绘制标准曲线，其标准偏差R2为0.9975，标准曲线方程为Abs(c)=2.9115(c)+0.0832。由于1molp-NPG被水解后产生1mol对硝基苯酚，因此溶液中p-NPG被完全催化能产生0.33mol对硝基苯酚，根据标准曲线得到对应吸光值为1.04。将反应测得吸光值与该值相比就可得到酶的相对活性。测定了30、40、50、60、70及80℃下纤维素固定化酶和游离酶的相对活性，其结果如图3。由此可知纤维素固定化酶的最适作用温度是50℃，与游离酶相比减少了10℃，并且在最适温度处的酶活性显著大于游离酶活性，从而有利于降低反应成本。利用不同浓度的底物测试在相同反应时间内生成产物的量对纤维素固定化酶系统进行酶动力学测试并与游离酶的结果作比较。当系统的最大反应速率Vmax越大，酶动力学参数KM值越小，表明此系统催化反应时最大反应速率越大，同时达到最大反应速率所需底物浓度越小，该系统越有优势。根据酶动力学方程V=Vmax[S]/(Km+[S])可得纤维素固定化酶每分钟的最大反应速率Vmax为0.0733±0.0034mmol/L，表示当其每分钟反应速率达到0.0733±0.0034mmol/L时，增加底物浓度其反应速率不会增加。酶动力学参数KM值为1.3826±0.2043mmol/L，表示是该系统达到最大反应速率所需要的底物浓度为1.3826±0.2043mmol/L。实施例3采用本发明实施例1的固定化酶处理黑豆浆：将50ml黑豆浆与50cm3纤维素固定化酶混合，在50℃条件下反应2h。取反应后的黑豆浆0.5ml，与0.5ml溶有2000ppm苯甲酸（内标）的甲醇溶液混合，离心3min取上清液0.5ml，与50%的甲醇水溶液混合，用0.45nm滤膜过滤后离心3min，用HPLC分析其中异黄酮组成及含量。大豆异黄酮含量计算：异黄酮含量（mM/L）=（As*CIS）/（AIS*RRF*MW）其中：As-异黄酮组分所对应HPLC图谱的积分面积；AIS-苯甲酸的PHLC图谱积分面积；CIS-内标浓度，250ppm；RRF-相对反应因子；MW-该异黄酮分子量。如图4和图5所示，分别为大豆异黄酮中大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木黄反应过程中的变化趋势，A为大豆苷、B为染料木苷。由图可知，大豆苷和染料木苷完全转化为所对应去糖基化形式所需时间分别为20min及30min；50%醣苷型异黄酮转化为所对应去醣基化形式所需时间分别为8min和9min。与使用霉菌发酵最少需要4-8h相比，该固定化酶系统具有明显的优势，能够在短时间内将黑豆浆中的异黄酮转化为具有高价值的去糖基化形式。