技术领域本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
背景技术：
木聚糖的基本糖单元是D-吡喃木糖，它的主链由木糖以β-1,4糖苷键连接形成，侧链上被各种不同的取代基所修饰，同时，这些侧链取代基团通过化学键互相交联，形成复杂的结构。木聚糖是半纤维素中最丰富的一类多糖类物质，广泛存在于硬木(15-30％)、软木(7-10％)和草本类植物(少于30％)中。木聚糖的降解需要主链水解酶和支链水解酶的协同作用，主链水解酶包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，侧链水解酶需要α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸，乙酰木聚糖酯酶等辅酶。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(α-l-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)能从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个阿拉伯糖分子。目前，人们已将细菌、真菌和植物来源的α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶进行分离纯化、或者通过基因克隆、异源表达之后，深入研究酶的各种性质。来源于微生物的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适反应pH为酸性至中性之间(pH3.0-7.0)，最适反应温度介于40-70℃之间。阿拉伯呋喃糖苷酶还被广泛应用于食品行业中，L-阿拉伯糖做为一种低摄入量的甜味剂能代替传统的蔗糖，适于老年人和高血糖患者食用。阿拉伯呋喃糖苷酶还能增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，提高酒的香味。其还能增加果汁的澄清度，而被应用于果汁生产工业。作为半纤维素降解酶系之一，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶参与低价的农产品残渣的再利用，产生可用于发酵生成燃料乙醇的单糖及其他副产品。在纤维素发酵生产燃料乙醇的过程中，有约70％的原材物将不能被完全降解生成单糖，适当的纤维素预处理过程可以加大纤维素的利用率。利用酶预处理的方法则减少了这些问题的发生。阿拉伯呋喃糖酶是半纤维素的侧链降解酶，它能促进半纤维素的完全降解。另外，阿拉伯糖呋喃糖苷酶作为一种饲料添加剂，去除了木聚糖上阿拉伯糖侧链，促进木聚糖的降解，易于被动物消化吸收。因此，阿拉伯呋喃糖苷酶的生产、纯化、性质特征及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。工业生产需要酶进行短期高温处理，目前多数阿拉伯呋喃糖苷酶最适温度在50度左右，但热稳定性差的性质不能满足饲料制粒，酿造加工等工业要求。因此获得热稳定性优良的酶能降低生产成本，满足不同工业对酶性质的要求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶。本发明的再一目的是提供编码上述耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的基因工程方法。本发明的另一目的提供上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶的应用。本发明从栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB中分离得到一种新的耐高温阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB。本发明提供了一种耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：其中，该酶基因编码502个氨基酸，无信号肽序列。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB在酸性和中性范围内具有较好的酶活力，并且具有很好的热稳定性。本发明筛选到栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB具有以下性质：最适pH4.5，并在pH2.0-6.0范围内具有60％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH2.0-8.0之间,剩余酶活性均在85％以上。最适温度50℃，60℃下仍具有60％以上的活性，良好的热稳定性，80℃都有较好的稳定性。本发明提供了编码上述耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的基因AbfaHLB。具体地，该基因的基因组序列如SEQIDNO.2所示：本发明通过PCR的方法分离克隆了阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的编码基因，DNA全序列分析结果表明，阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因abfaHLB全长1509bp。成熟蛋白理论分子量为56.6kDa，将阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的编码基因序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Alicyclobacillushesperidum的阿拉伯呋喃糖苷酶序列一致性为77％。说明AbfaHLB是一种新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组载体，优选为pPIC9-abfaHLB。将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达质粒pPIC9-abfaHLB。本发明还提供了包含上述耐高温阿拉伯呋喃糖苷基因abfaHLB的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步优选为毕赤酵母菌，例如，重组菌株GS115/abfaHLB。本发明还提供了一种制备耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶表达；3)回收并纯化所表达的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母GS115，得到重组菌株GS115/abfaHLB。本发明还提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的应用。优选地，提供上述阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB在饲料和食品工业中的应用，进一步优选在饲料和食品工业中降解阿拉伯木聚糖的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的阿拉伯呋喃糖苷酶。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶最适pH为4.5，在pH2.0-6.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本阿拉伯呋喃糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本阿拉伯呋喃糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。本发明中来源于栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB具有以下性质：最适pH4.5，并在pH2.0-6.0范围内具有60％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH2.0-8.0之间,剩余酶活性均在80％以上。最适温度50℃，60℃下仍具有60％以上的活性，良好的热稳定性，80℃都有较好的稳定性。良好的pH和热稳定性等特性使其在饲料，食品工业应用上具有很大的潜力。附图说明图1为本发明的重组耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的最适pH。图2为本发明的重组耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的pH稳定性。图3为本发明的重组耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度。图4为本发明的重组耐高温酸性阿拉伯呋喃糖苷酶的热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH自然)。(2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。(3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH自然。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB中阿拉伯呋喃糖苷酶基因abfaHLB的克隆提取栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB基因组DNA：(1)取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；(2)EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；(3)对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；(4)12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；(5)加RNaseA(25mg/mL)溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；(6)加结合液CB800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；(7)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；(8)加抑制物去除液IR500μL，12000rpm离心30s，弃废液；(9)加入700μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；(10)加入500μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；(11)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；(12)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；(13)得到的DNA于-20℃保存。从NCBI基因数据库中获取芽孢杆菌来源阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB基因序列进行序列比对分析，设计合成引物P1，P2：P1:5'-ATGTCTATGGATGTAGATCCACGTTTA-3'；P2:5'-TACATTTACACGTAAACGAATCCAAGA-3'。以栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min，获得一条约1500bp大小的片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体进行连接转化后送北京睿博新科生物技术有限公司测序。通过基因测序得到1509bp的基因片段，编码502个氨基酸和一个终止密码子。实施例2阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的制备根据获得的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的基因序列设计合成表达引物：P3:5'-GATGAATTCATGTCTATGGATGTAGATCCACGTTTA-3'；P4:5'-GCTGCGGCCGCTACATTTACACGTAAACGAATCCAAGA-3'。重新以栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB总DNA为模板进行PCR扩增，获得带有重组酶切位点的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB基因。将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abfaHLB双酶切(EcoRI+NotI)，酶切出编码成熟阿拉伯呋喃糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有BacillusbadiusHLB阿拉伯呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组质粒pPIC-abfaHLB并电击转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/abfaHLB。将含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后利用200mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定阿拉伯呋喃糖苷酶的活力，重组阿拉伯呋喃糖苷酶的表达量为60U/mL。实施例3重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的活性分析阿拉伯呋喃糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPAf生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL2mMpNPAf底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于40℃反应10min，加入1.5mL1MNa2CO3终止反应，于405nm处测定OD值。实施例4重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的性质测定1、重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适pH和pH稳定性的测定将实施例3纯化的重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置，在37℃条件下进行阿拉伯呋喃糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，重组阿拉伯呋喃糖苷酶的最适pH为4.5，在pH2.0-7.0有50％以上的相对酶活性。重组阿拉伯呋喃糖苷酶在上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中37℃条件下测定酶活性，以研究重组酶的pH稳定性。结果(图2)表明重组阿拉伯呋喃糖苷酶在pH2.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在85％以上，这说明此酶pH耐受性较为宽泛。2、重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适温度及热稳定性测定重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB在不同温度下处理不同时间，然后在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为50℃，在20-65℃下均保持较高酶活。酶的热稳定性试验表明(图4)，重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB具有良好的热稳定性，在70℃下温育2h，能保持90％以上的酶活性，而且在80℃下温育10min，能剩余80％以上的酶活性。3、不同化学试剂对重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB活性的影响在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L。在50℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂β-巯基乙醇和EDTA在浓度为1mmol时重组阿拉伯呋喃糖苷酶的活力没有明显变化。但是Ag+、Hg2+几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。4、重组阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力检测用pH2.0Gly-HCl缓冲液配置0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置0.1mg/mL胰蛋白酶。将纯化的阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB与蛋白酶按10：1(w/w)比例在该蛋白酶缓冲液中处理120min后，不同的时间取样，按标准方法检测处理酶的剩余酶活。结果表明，阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB用胃蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力为96.9％，用胰蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力94.7％。说明阿拉伯呋喃糖苷酶AbfaHLB具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。