本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组MSI生物标志物及其相关试剂盒。
背景技术：
微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。出现新的微卫星等位基因现象的机制包括DNA多聚酶的滑动导致重复序列中1个或多个碱基的错配以及MS同源重组导致碱基对的丢失和插入。MSI状况的评估对于确定身源鉴定中的计算方法选用有一定参考意义。另外，检测肿瘤组织的MSI状况可以评估肿瘤组织的遗传稳定性特点，作为后续处理的参考依据。
1993年，Altonen等首次发现在HNPCC细胞中存在高频率的MSI。1997年NCI制定Bethesda指南推荐检测BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123和D17S250等五个位点来评估MSI状况。2002年NCI依据研究进展推出改进版Bethesda指南，推荐检测的位点BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27来评估MSI状况。近年研究中发现，NR22、NR27和CAT25对判断MSI状况有参考价值。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一组MSI生物标志物及其相关试剂盒，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一组MSI生物标志物，所述MSI生物标志物包括：NR21、BAT25、BAT26、NR27、NR24、NR22、CAT25、MONO27、D17S250、D5S436、D2S123、AMEL、CS1PO、D18S51和TPOX。
具体的，所述NR21、BAT25、BAT26、NR27、NR24、NR22、CAT25和MONO27为单碱基重复多态性位点；所述D17S250、D5S436和D2S123为双碱基重复多态性位点；所述AMEL为INDEL位点；所述CS1PO、D18S51和TPOX为STR位点。
本发明第二方面提供所述MSI生物标志物在制备或筛选MSI诊断药物中的用途。
优选的，所述MSI为人MSI。
本发明第三方面提供一种MSI诊断试剂盒，包括针对NR21的特异性引物、针对BAT25的特异性引物、针对BAT26的特异性引物、针对NR27的特异性引物、针对NR24的特异性引物、针对NR22的特异性引物、针对CAT25的特异性引物、针对MONO27的特异性引物、针对D17S250的特异性引物、针对D5S436的特异性引物、针对D2S123的特异性引物、针对AMEL的特异性引物、针对CS1PO的特异性引物、针对D18S51的特异性引物、针对TPOX的特异性引物。
具体的，所述针对NR21的特异性引物包括如SEQ ID No：1所示的前引物，序列如SEQ ID No：2所示的后引物。
具体的，所述针对BAT25的特异性引物包括如SEQ ID No：3所示的前引物，序列如SEQ ID No：4所示的后引物。
具体的，所述针对BAT26的特异性引物包括如SEQ ID No：5所示的前引物，序列如SEQ ID No：6所示的后引物。
具体的，所述针对NR27的特异性引物包括如SEQ ID No：7所示的前引物，序列如SEQ ID No：8所示的后引物。
具体的，所述针对NR24的特异性引物包括如SEQ ID No：9所示的前引物，序列如SEQ ID No：10所示的后引物。
具体的，所述针对NR22的特异性引物包括如SEQ ID No：11所示的前引物，序列如SEQ ID No：12所示的后引物。
具体的，所述针对CAT25的特异性引物包括如SEQ ID No：13所示的前引物，序列如SEQ ID No：14所示的后引物。
具体的，所述针对MONO27的特异性引物包括如SEQ ID No：15所示的前引物，序列如SEQ ID No：16所示的后引物。
具体的，所述针对D17S250的特异性引物包括如SEQ ID No：17所示的前引物，序列如SEQ ID No：18所示的后引物。
具体的，所述针对D5S436的特异性引物包括如SEQ ID No：19所示的前引物，序列如SEQ ID No：20所示的后引物。
具体的，所述针对D2S123的特异性引物包括如SEQ ID No：21所示的前引物，序列如SEQ ID No：22所示的后引物。
具体的，所述针对AMEL的特异性引物包括如SEQ ID No：23所示的前引物，序列如SEQ ID No：24所示的后引物。
具体的，所述针对CS1PO的特异性引物包括如SEQ ID No：25所示的前引物，序列如SEQ ID No：26所示的后引物。
具体的，所述针对D18S51的特异性引物包括如SEQ ID No：27所示的前引物，序列如SEQ ID No：28所示的后引物。
具体的，所述针对TPOX的特异性引物包括如SEQ ID No：29所示的前引物，序列如SEQ ID No：30所示的后引物。
所述各特异性引物在一个体系内可以同时正常扩增，相互之间无干扰峰，可以在一个反应使用。
在本发明一具体实施方式中，所述各特异性引物的浓度范围可以为0.05μM到1μM。
具体的，每组特异性引物中，至少有一条引物上标记有荧光标记物。
更具体的，所述荧光标记物选自FAM、HEX、TAMRA中的一种或多种的组合。
如上所述，本发明所提供的检测试剂盒能够有效覆盖各MSI的检测位点，通过和现行数据库对比分析，能够有效提高判断效率，且能够有效提高鉴别样本来源同一性的能力，避免试验中出现结果混淆。
附图说明
图1显示为本发明实施例3中人9947A DNA标准品MSI检测结果示意图。三个通道左侧数值为相对荧光强度，上方数值为产物长度(bp)，通道内标注位点名称。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
10倍9947A DNA(promega)制备：
使用去离子水将9947A DNA(promega)稀释到10ng/μL，分装备用。
实施例2
5倍引物混合物制备：
依据Genbank记录的NR21、BAT25、BAT26、NR27、NR24、NR22、CAT25、MONO27、D17S250、D5S436、D2S123、AMEL、CS1PO、D18S51和TPOX位点序列资料和群体遗传学数据，设计15个位点扩增引物。每对引物中一个引物以设计荧光物质标记，15个位点的位置与标记设计如表1所示，具体序列和标记如表2所示。
表1
表2
引物按合成标注的nM数加10倍nM数μL的去离子水配制100μM贮存液，作为50倍贮存液。实验中从第一对引物开始，以每次添加一条引物的方法依次加入，以9947A为标准品观察引物扩增效率以及对其它位点的影响，并依据峰高调整每条引物用量，最后达到各位点间扩增差异符合位点间差异小于50％的产品质量要求，引物混合物加水调节浓度至5倍。
实施例3
样品检测分析：
样品准备：标准品9947A DNA(promega)调节浓度为1ng/μL；阳性检测样本外周血DNA以及肿瘤组织DNA调节浓度为1ng/μL。
PCR体系：5倍引物2μL，DNA模板1μL，2倍Multiplex PCRMixture(Qiagen)5μL，去离子水2μL；
PCR扩增条件：AB Theram cycler 9700PCR仪，95℃15分钟预变性--95℃30秒变性-60℃30秒退火-72℃一分钟延伸扩增30循环--68℃加A 60分钟；
毛细管电泳：使用ABI Genetic Analyzer做片段长度电泳；
结果分析：采用Genemapper I D V2.3软件包分析。分析时9947A应该在预订位置出现扩增峰；以外周血DNA作为正常对照，如果检测肿瘤组织中待检测位点出现新扩增峰、扩增峰型变化则判断该位点出现MSI，按1997和2002年Bethesda指南标准分别作出肿瘤组织MSI状态判断(1个位点变异定义为MSI-L、两个或以上位点变异定义为MSI-H、无位点变异定义为MSS)。Amel Indel多态性以及3个STR(CS1PO，D18S51和TPOX)作为样本配对核实位点，用于确定比较的样本来源于同一个个体，避免样本混淆。
实施例4
临床数据回顾性验证：
对100名T3/N0M0结肠癌患者，术后接受常规5FU化疗，观察期已经达到5年。调取常规FFPE肿瘤组织和外周血抽提DNA，使用本试剂盒检测MSI情况，发现即便结合使用Bethesda97和Bethesda02标准(按1997年Bethesda指南标准，在BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123和D17S250等5个位点中，出现1个位点变异定义为MSI-L、两个或以上位点变异定义为MSI-H、无位点变异定义为MSS；依据2002年Bethesda指南标准，在BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27等5个位点中，出现1个位点变异定义为MSI-L、两个或以上位点变异定义为MSI-H、无位点变异定义为MSS)，依然有MSI病例遗漏。从5年生存和病死的数据也可以看出97和02标准中部分MSS病例表现为化疗抵抗(可以被认为是MSI漏检病例)，结果如表3所示。
表3
实施例5
将实施例3制备获得的5倍引物混合装入棕色避光管，2倍PCR混合物装入透明EP管。试剂盒主要技术指标：
人基因组DNA浓度10-20ng/uL为推荐浓度，低至1ng/uL可检出；检测方法参照实施例3；
9947A标准品扩增位点之间差异小于50％，使用实施例2所得5倍引物混合物重复对9947A样品进行检测，检测方法参照实施例3，重复检测的结果一致；
使用实施例2所得5倍引物混合物重复对小鼠、大鼠、鸡、猪及牛基因组DNA进行检测，检测方法参照实施例3，无扩增；
热稳定性:室温(25℃)放置24小时检测效力无明显影响；
冻融实验：从-20℃取出，室温(25℃)完全解冻后重新放入-20℃，每天一次。反复冻融7次检测效力无明显影响；
保存条件、时间：-20℃保存1年，检测效力无明显影响。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的检测结果不够准确、可能遗漏MSI样本等缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。