本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体涉及一种狭旋毛壳菌及其在制备可皆霉素中的应用。
背景技术：
狭旋毛壳属于子囊菌门毛壳属真菌，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够应用于植物病害的防治。可皆霉素(Cochliodinol，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0)仅在毛壳属（Chaetomium globosum,C. cochliodes）中分离得到，其结构式为
。
Brewerr的科研团队发现，在1-10μg/ml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌Botrytis allii 和 Fusarirm moniliforme孢子的萌发，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长；同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长，而镰刀菌可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的病害之一。由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。另外，Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53 μM、2.20μM。
综上所述，可皆霉素具有多重重要的生物活性，但由于合成成本高，得率低，无法获得大量纯品，难以进行更深入研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可大量生产可皆霉素的狭旋毛壳菌及其在制备可皆霉素中的应用。
为解决上述问题，本发明提供一种狭旋毛壳菌，其保藏的分类学名称为狭旋毛壳(Chaetomium angustispirale) CLC001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2016年4 月28 日，保藏号为CCTCC NO：M 2016231。该菌在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素。该菌的18S rDNA如序列表所示，即
CGTGGGTCTTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAACCCGCAGCACGCCCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGTGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTTTCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTAACAAGAGTTTGGTGACCTCCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCAACGGTTTAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCTACGGAAG。
所述的狭旋毛壳菌在制备可皆霉素中的应用，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；
（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm、温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0±0.1；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5:100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm、温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH6.0±0.1；
（4）甲醇提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用甲醇作为提取溶剂，超声提取，得到甲醇提取液，40~45℃下减压除去甲醇后得到甲醇提取物；
（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的甲醇提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:（2~4）的流份，40~45℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。
所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1。
所述步骤（4）中将狭旋毛壳菌体用甲醇提取时，用甲醇提取3次，每次提取时狭旋毛壳菌体与甲醇的固液比为1g︰60ml、每次提取时于20~25℃下超声20 min。
所述步骤（5）中将甲醇提取物与80～100目硅胶拌样时，甲醇提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。
本发明产生的有益效果是：本发明中提供的狭旋毛壳(Chaetomium angustispirale) CLC001可在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素；本发明的提取方法简单，成本低，并具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
所述的狭旋毛壳菌在制备可皆霉素中的应用，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种（来自于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2016231）接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；
（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm、温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0±0.1；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5:100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm、温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液20L；培养液B的配方为：葡萄糖40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH6.0±0.1；
（4）甲醇提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用甲醇作为提取溶剂，超声提取3次（每次23℃下超声20 min，每次提取时狭旋毛壳菌体与甲醇的固液比为1g︰60ml），得到甲醇提取液，45℃下减压除去甲醇后得到甲醇提取物；
（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的甲醇提取物用80～100目硅胶拌样后装柱（甲醇提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2），固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱(二氯甲烷－甲醇体积比为100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，硅胶薄层层析，紫外254 nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:2和100:4的流份，45℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素10.1g（纯度为98.8%）。
本实施例所提取到的可皆霉素的结构鉴定如下：
【性状】紫色粉末
【鉴定】分子式：C32H30N2O4, 分子量：506.2206
仪器设备：Agilent 1100液相色谱仪, 1H, 13C NMR 图谱由 Bruker am-400 MHz 核磁共振仪测定(TMS为内标),质谱由Agilent 6490 型质谱仪测定。
利用ESI-MS，1H NMR和13C NMR试验，标准数据如下：ESI-MS m/z: 505.2124 [M-H]+; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.41 (1H, s, 2,5-OH), 8.13 (1H, s, 1-NH), 7.60 (1H, s, H-2), 7.44 (1H, s, H-4), 7.34 (1H, d, J = 8.4, H-7),7.08 (1H, d, J = 8.4, H-6), 5.40 (1H, m, H-11), 3.46 (1H, m, H-10), 1.75 (3H, s, 13-CH3), 1.74 (1H, s, 14-CH3); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ:134.4 (C-8), 133.9 (C-5), 131.7 (C-12), 127.2 (C-2), 126.3 (C-9), 124.5 (C-11), 123.6 (C-6), 120.9 (C-4), 111.1 (C-7), 110.8 (C-3, C-6), 104.4 (C-3), 34.7 (C-10), 25.8 (C-14), 17.9 (C-13).
【检查】利用TLC，在UV 254nm呈强荧光；以硫酸显色剂，110℃下20秒钟，呈现棕色。
【含量测定】利用HPLC，色谱条件：Sepax GP-C18 5μm（250mm×4.6mm）色谱柱。流动相：乙腈︰水︰甲酸为10︰90︰0.1；流速：1.25 mL/min，检测波长254nm，保留时间值9.46 min。
对照例1
对照例1与实施例1的不同之处在于：所述步骤（4）中的提取溶剂为丙酮，步骤（5）中所得可皆霉素的量为3.78 g。
对照例2
对照例1与实施例1的不同之处在于：所述步骤（4）中的提取溶剂为乙腈，步骤（5）中所得可皆霉素的量为1.87 g。
对照例3
对照例1与实施例1的不同之处在于：所述步骤（4）中的提取溶剂为二氯甲烷，步骤（5）中所得可皆霉素的量为0.45g。
对照例4
对照例1与实施例1的不同之处在于：所述步骤（4）中用甲醇提取时每次提取时狭旋毛壳菌体与甲醇的固液比为1g︰50ml，步骤（5）中所得可皆霉素的量为6.85g。
对照例5
对照例1与实施例1的不同之处在于：所述步骤（4）中用甲醇提取时每次提取时狭旋毛壳菌体与甲醇的固液比为1g︰100ml，步骤（5）中所得可皆霉素的量为7.67g。
SEQUENCE LISTING
<110> 黄河科技学院
<120> 一种狭旋毛壳菌及其在制备可皆霉素中的应用
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> Chaetomium angustispirale
<400> 1
cgtgggtctt tctacctgat ccgaggtcac cttgggttaa aaggtggttt aacggccgga 60
acccgcagca cgcccagagc gagatgtatg ctactacgct cggtgtgaca gcgagcccgc 120
cactgctttt cagggcctgc ggcagccgca ggtccccaac acaagcccgg gggcttgatg 180
gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc 240
aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt 300
cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgacttat tcagtacaga 360
agactcagag aggccataaa ttaacaagag tttggtgacc tccggcgggc gcccgcggtg 420
gggcccaggg gcgcccgggg ggtaaacccc ggggccgccc gccgaagcaa cggtttaggt 480
aacgttcaca atggtttagg gagttttgca actctgtaat gatccctccg caggtccccc 540
tacggaag 548