技术领域本发明涉及生物技术领域中心肌细胞特异启动子及其应用。
背景技术：
进入21世纪以来，心血管疾病已经成为了威胁人类健康的重要疾病。在全球范围内，心血管疾病的发病率呈现逐年升高的趋势，在我国，心血管病患者大约有2.3亿人，每年死于心血管病的约300万人，可以说，心血管疾病已经成为威胁人类健康的第一杀手。心力衰竭是心血管疾病导致死亡的主要原因之一，约有40％的心血管疾病发展成为心力衰竭，因此，探明心衰发病的原因，机理，以及找到恰当的治疗心衰靶位点的意义十分重大。心力衰竭的发病机制非常复杂，已经有很多的研究者从不同的角度出发来阐明心力衰竭的发展过程。研究证明，有大量的细胞内分子信号通路参与了这一过程，例如：压力负荷是引起心力衰竭的一个重要因素，病理性的压力通过G蛋白耦联受体，钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CAMKII)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，蛋白质磷酸酶钙调磷酸酶，和转录因子心肌细胞增强因子2(MEF2)，活性T细胞核因子(NFAT)这一信号通路，最终引起心衰相关基因的表达的变化，从而引起心肌细胞的肥大，衰竭。这些复杂的信号通路有相当一部分是相互重叠与相互影响的，在不同信号通路相互重叠的节点，例如GSK3β，HDACs极可能成为心衰治疗的重要靶点。在对心脏疾病进行基因治疗时，如何对完成对心脏靶向作用成为其中的重要一环，目前急需一种具有心脏或心肌细胞特异性的启动子。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供具有心肌细胞特异性启动子功能DNA分子。为解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于大鼠(Rattusnorvegicus)的DNA分子，该DNA分子的名称为CMRP，CMRP具有心肌细胞特异性启动子功能，CMRP是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)3′端至少含有序列表中序列1的第927-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第927位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为575至1501bp的任意一个DNA片段；所述DNA片段具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。其中，序列1由1501个核苷酸组成。上述DNA分子中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述DNA分子中，CMRP的最后一位核苷酸是序列1的第1501位。上述DNA分子中，CMRP还可为下述A1)-A8)中的任一种DNA片段：A1)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第913-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第913位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为589至1501bp的任意一个DNA片段；A2)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第888-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第888位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为614至1501bp的任意一个DNA片段；A3)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第870-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第870位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为632至1501bp的任意一个DNA片段；A4)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第848-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第848位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为654至1501bp的任意一个DNA片段；A5)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第827-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第827位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为675至1501bp的任意一个DNA片段；A6)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第789-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第789位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为713至1501bp的任意一个DNA片段；A7)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第819-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第819位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为683至1501bp的任意一个DNA片段；A8)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中序列1的第1051-1501位核苷酸序列，并且从序列1的第1051位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为451至1501bp的任意一个DNA片段。上述DNA分子中，CMRP可为下述1)-10)中任意一种：1)序列表中序列1的第927-1051位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1的第913-1051位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1的第888-1051位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1的第870-1051位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表中序列1的第848-1051位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列1的第827-1051位核苷酸所示的DNA分子；7)序列表中序列1的第713-1051位核苷酸所示的DNA分子；8)序列表中序列1的第683-1051位核苷酸所示的DNA分子；9)序列表中序列1的第451-1051位核苷酸所示的DNA分子；10)序列表中序列1的第1-1051位核苷酸所示的DNA分子。为解决上述技术问题，本发明还提供了含有CMRP的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B13)中的任一种：B1)含有CMRP的表达盒；B2)含有CMRP的重组载体；B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；B4)含有CMRP的重组微生物；B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有CMRP的转基因动物细胞系；B9)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系；B10)含有CMRP的转基因动物组织；B11)含有B1)所述表达盒的转基因动物组织；B12)含有CMRP的转基因动物器官；B13)含有B1)所述表达盒的转基因动物器官。上述生物材料中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织和所述转基因动物器官均不包括动物的繁殖材料。上述生物材料中，所述表达盒可由CMRP、CMRP启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；CMRP以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因(luc)。所述重组载体中，由CMRP启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pGL3-Basic载体的多克隆位点插入CMRP得到的重组载体。所述多克隆位点具体为限制性内切酶识别位点MluI和NheI。所述目的基因具体为荧光素酶基因(luc)。上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因动物细胞或组织或器官。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1-M4中任一应用：M1、CMRP在作为启动子中的应用；M2、CMRP在作为心脏特异启动子中的应用；M3、CMRP在作为心肌特异启动子中的应用；M4、CMRP在作为心肌细胞特异启动子中的应用。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述N1-N3中任一应用：N1、CMRP在心脏中启动目的基因表达中的应用；N2、CMRP在心肌中启动目的基因表达中的应用；N3、CMRP在心肌细胞中启动目的基因表达中的应用。为解决上述技术问题，本发明还提供了CMRP在动物中启动目的基因表达中的应用。上述应用中，所述表达可为心脏特异表达，如心肌细胞特异表达。在本发明的一个具体实施方式中，所述心肌细胞具体可为乳鼠心肌细胞。为解决上述技术问题，本发明还提供了CMRP在培育转基因动物(如抗心脏疾病的转基因动物)中的应用。本发明中，所述动物可为陆生动物，如哺乳动物。实验证明，本发明的启动子以及不同截短片段——CMRP-575、CMRP-589、CMRP-614、CMRP-632、CMRP-654、CMRP-675、CMRP-789、CMRP-819、CMRP-1051和CMRP均可启动报告基因luc(荧光素酶)在心肌细胞中表达，且还证明这些启动子启动报告基因的表达luc(荧光素酶)具有心肌细胞特异性，说明本发明的启动子具有良好的心肌组织特异性和心脏特异性。本发明的启动子可用于培育转基因动物(如抗心脏疾病的转基因动物)，本发明的启动子在生命科学研究领域以及心脏疾病基因治疗领域有一定的应用前景。附图说明图1为不同重组细胞的荧光素酶相对活性的检测结果。其中，1501表示C-pGL3-CMRP，533表示C-pGL3-CMRP-533，555表示C-pGL3-CMRP-555，575表示C-pGL3-CMRP-575，589表示C-pGL3-CMRP-589，614表示C-pGL3-CMRP-614，632表示C-pGL3-CMRP-632，654表示C-pGL3-CMRP-654，675表示C-pGL3-CMRP-675，789表示C-pGL3-CMRP-789，819表示C-pGL3-CMRP-819，1051表示C-pGL3-CMRP-1051，Con表示C-pGL3-Basic。**表示荧光素酶相对活性极显著低于C-pGL3-CMRP。图2为C-pGL3-CMRP、Hek293-pGL3-CMRP与Hela-pGL3-CMRP的荧光素酶相对活性。其中，NRCM表示C-pGL3-CMRP，Hek293表示Hek293-pGL3-CMRP，Hela表示Hela-pGL3-CMRP。具体实施方式本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(例如，报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入动物细胞或动物组织的任何一种动物转化方法，如原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等。术语“具有75％或75％以上同一性的序列”是指与上述启动子的核苷酸序列相比有75％或75％以上的核苷酸序列相同或相似的核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的肺组织特异性表达，它们与上述启动子中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的载体pGL3-Basic为promega公司产品，产品目录号为E1751。实施例1、启动子CMRP心肌细胞特异性启动子功能的鉴定本发明提供了来源于SD大鼠(Rattusnorvegicus)(北京维通利华实验动物有限公司)的DNA分子，该DNA分子的名称为CMRP，CMRP具有心肌细胞特异性启动子功能，CMRP的序列如序列表中序列1所示，其中序列1的第1位为CMRP的5′端，最后一位为CMRP的3′端，序列1由1501个核苷酸组成。将CMRP进行截短，分别得到如下DNA分子：CMRP-533、CMRP-555、CMRP-575、CMRP-589、CMRP-614、CMRP-632、CMRP-654、CMRP-675、CMRP-789、CMRP-819、CMRP-1051。各DNA分子的序列如下：CMRP-533的序列为序列1的969-1051位；CMRP-555的序列为序列1的947-1051位；CMRP-575的序列为序列1的927-1051位；CMRP-589的序列为序列1的913-1051位；CMRP-614的序列为序列1的888-1051位；CMRP-632的序列为序列1的870-1051位；CMRP-654的序列为序列1的848-1051位；CMRP-675的序列为序列1的827-1051位；CMRP-789的序列为序列1的713-1051位；CMRP-819的序列为序列1的683-1051位；CMRP-1051的序列为序列1的451-1051位。1、重组载体的构建将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的CMRP，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP，pGL3-CMRP中，CMRP的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-533，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-533，pGL3-CMRP-533中，CMRP-533的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-555，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-555，pGL3-CMRP-555中，CMRP-555的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-575，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-575，pGL3-CMRP-575中，CMRP-575的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-589，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-589，pGL3-CMRP-589中，CMRP-589的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-614，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-614，pGL3-CMRP-614中，CMRP-614的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-632，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-632，pGL3-CMRP-632中，CMRP-632的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-654，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-654，pGL3-CMRP-654中，CMRP-654的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-675，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-675，pGL3-CMRP-675中，CMRP-675的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-789，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-789，pGL3-CMRP-789中，CMRP-789的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-819，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-819，pGL3-CMRP-819中，CMRP-819的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。将载体pGL3-Basic的MluI和NheI识别序列间的DNA片段替换为CMRP-1051，得到重组载体，将该重组载体命名为pGL3-CMRP-1051，pGL3-CMRP-1051中，CMRP-1051的5′端与MluI的识别序列相连，3′端与NheI的识别序列相连。2、CMRP在新生乳鼠心肌细胞中具有启动子活性2.1细胞转染将步骤1的重组载体与pGL3-Basic分别转染至新生乳鼠心肌细胞中。2.1.1新生乳鼠心肌细胞的制备1)无钙的HANKS缓冲液中加入0.1％的胰酶和0.08％的胶原酶配制成消化液，用0.05μm滤膜过滤除菌。2)剖取新生乳鼠(北京维通利华实验动物有限公司)心脏，加入一定量的HANKS缓冲液，在小皿中用剪刀剪碎，组织块大小在直径1mm左右。3)将剪碎的组织块和HANKS缓冲液一起转移到消化瓶中，静置1min，待组织块全部沉到瓶底后吸弃HANKS缓冲液。4)加入5ml消化液，在37摄氏度水浴中搅拌消化6min，取出消化瓶，静置1min，吸弃消化液。5)再加入5ml消化液，在37摄氏度水浴中搅拌消化6min，取出消化瓶，静置1min，吸出消化液转移到洁净的15ml离心管中，加入5mlDMEM10％FBS培养基中和消化液。重复该步骤6次。6)将中和后的消化液1000r/min理性5min，弃上清后加入1mlDMEM10％FBS培养基重悬。7)收集多次消化所得的重悬液，用50目的滤网进行过滤除去未完全消化的组织块，将过滤后的细胞重悬液平铺于10ml培养皿中，加入5mlDMEM10％FBS培养基，摇匀后置于37摄氏度培养箱中2h，利用差速贴壁的方式除去成纤维细胞，得到新生乳鼠心肌细胞(心肌细胞)。2.1.2细胞转染具体操作步骤如下：1)提前预热opti-MEM培养基至37℃；于转染前半小时将步骤2.1.1培养皿中的含有新生乳鼠心肌细胞的培养基转移到50ml离心管中，并将培养基换成预热的opti-MEM。2)将步骤1的重组载体或pGL3-Basic与lipo2000分别加入一定体积的opti-MEM中，载体与lipo2000的比值为1μg:2μl，常温孵育5min。3)将含有lipo2000的opti-MEM加入含有质粒的opti-MEM中，混匀后常温孵育30min。4)将混合好的opti-MEM溶液加入步骤1)的培养体系中，6h后将opti-MEM培养基更换为DMEM10％FBS培养基。最后得到分别将pGL3-CMRP、pGL3-CMRP-533、pGL3-CMRP-555、pGL3-CMRP-575、pGL3-CMRP-589、pGL-3CMRP-614、pGL3-CMRP-632、pGL3-CMRP-654、pGL3-CMRP-675、pGL3-CMRP-789、pGL3-CMRP-819、pGL3-CMRP-1051和pGL3-Basic导入心肌细胞得到重组细胞，将这些重组细胞依次命名为C-pGL3-CMRP、C-pGL3-CMRP-533、C-pGL3-CMRP-555、C-pGL3-CMRP-575、C-pGL3-CMRP-589、C-pGL3-CMRP-614、C-pGL3-CMRP-632、C-pGL3-CMRP-654、C-pGL3-CMRP-675、C-pGL3-CMRP-789、C-pGL3-CMRP-819、C-pGL3-CMRP-1051和C-pGL3-Basic。2.2荧光素酶相对活性测定与分析采用promega的双荧光试剂盒进行，具体步骤如下：1)将1倍体积的PassiveLysisbuffer(PLB)加到4倍体积超纯水中，混合均匀。2)将步骤2.1.2转染后的细胞培养基吸弃，加入稀释好的PLB，于摇床上振摇裂解15min。3)将裂解液吸出转移至离心管中，瞬离1min。4)取上清10μl加入96孔板的一个孔中，加入50μlLARII试剂，反应数秒，利用酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性。5)加入50μlStop&GloiReagent，反应数秒，利用酶标仪检测海肾荧光素酶活性。各重组细胞的萤火虫荧光酶素(Luc)相对于海肾荧光素酶活力(Rluc)的荧光素酶相对活性的检测结果如图1所示。结果显示，C-pGL3-CMRP、C-pGL3-CMRP-575、C-pGL3-CMRP-589、C-pGL3-CMRP-614、C-pGL3-CMRP-632、C-pGL3-CMRP-654、C-pGL3-CMRP-675、C-pGL3-CMRP-789、C-pGL3-CMRP-819和C-pGL3-CMRP-1051的荧光素酶相对活性均极显著高于C-pGL3-Basic，表明，CMRP、CMRP-575、CMRP-589、CMRP-614、CMRP-632、CMRP-654、CMRP-675、CMRP-789、CMRP-819和CMRP-1051在心肌细胞中均具有启动子活性；C-pGL3-CMRP-555和C-pGL3-CMRP-533的荧光素酶相对活性分别为C-pGL3-CMRP的20％左右和10％左右，C-pGL3-CMRP-533的荧光素酶相对活性与C-pGL3-Basic无显著差异，表明，CMRP-555和CMRP-533在心肌细胞中的启动子活性降低，CMRP-555和CMRP-533在心肌细胞中几乎无启动子活性。3、CMRP启动子活性特异性检测将步骤1的pGL3-CMRP、pGL3-CMRP-575、pGL3-CMRP-589、pGL3-CMRP-614、pGL3-CMRP-632、pGL3-CMRP-654、pGL3-CMRP-675、pGL3-CMRP-789、pGL3-CMRP-819、pGL3-CMRP-1051和pGL3-Basic分别转染Hek293细胞(ATCC细胞库，编号CRL-1573)和Hela细胞(ATCC细胞库，编号CCL-2.1)，具体方法如下：1)提前预热opti-MEM培养基至37℃；用相应的培养基培养Hek293细胞或Hela细胞，并将培养基换成预热的opti-MEM。2)将载体与lipo2000分别加入一定体积的opti-MEM中，载体与lipo2000的比值为1μg:2μl，常温孵育5min。3)将含有lipo2000的opti-MEM加入含有载体的opti-MEM中，混匀后常温孵育30min。4)将混合好的opti-MEM溶液加入步骤1)的培养体系中，6h后将opti-MEM培养基更换为相应细胞的培养基。其中，Hek293细胞的培养基为DMEM(gibco)+10％FBS(thermofisher)，Hela细胞的培养基为DMEM(gibco)+10％FBS(thermofisher)。将pGL3-CMRP、pGL3-CMRP-575、pGL3-CMRP-589、pGL3-CMRP-614、pGL3-CMRP-632、pGL3-CMRP-654、pGL3-CMRP-675、pGL3-CMRP-789、pGL3-CMRP-819、pGL3-CMRP-1051和pGL3-Basic导入Hek293细胞得到重组细胞，将这些重组细胞依次命名为Hek293-pGL3-CMRP、Hek293-pGL3-CMRP-575、Hek293-pGL3-CMRP-589、Hek293-pGL3-CMRP-614、Hek293-pGL3-CMRP-632、Hek293-pGL3-CMRP-654、Hek293-pGL3-CMRP-675、Hek293-pGL3-CMRP-789、Hek293-pGL3-CMRP-819、Hek293-pGL3-CMRP-1051和Hek293-pGL3-Basic；将pGL3-CMRP、pGL3-CMRP-575、pGL3-CMRP-589、pGL3-CMRP-614、pGL3-CMRP-632、pGL3-CMRP-654、pGL3-CMRP-675、pGL3-CMRP-789、pGL3-CMRP-819、pGL3-CMRP-1051和pGL3-Basic导入Hela细胞得到重组细胞，将这些重组细胞依次命名为Hela-pGL3-CMRP、Hela-pGL3-CMRP-575、Hela-pGL3-CMRP-589、Hela-pGL3-CMRP-614、Hela-pGL3-CMRP-632、Hela-pGL3-CMRP-654、Hela-pGL3-CMRP-675、Hela-pGL3-CMRP-789、Hela-pGL3-CMRP-819、Hela-pGL3-CMRP-1051和Hela-pGL3-Basic。按照步骤2中荧光素酶相对活性测定与分析方法分别分析上述各重组细胞的荧光素酶相对活性，结果显示，Hek293-pGL3-CMRP、Hek293-pGL3-CMRP-575、Hek293-pGL3-CMRP-589、Hek293-pGL3-CMRP-614、Hek293-pGL3-CMRP-632、Hek293-pGL3-CMRP-654、Hek293-pGL3-CMRP-675、Hek293-pGL3-CMRP-789、Hek293-pGL3-CMRP-819和Hek293-pGL3-CMRP-1051的荧光素酶相对活性均与Hek293-pGL3-Basic无显著差异；Hela-pGL3-CMRP、Hela-pGL3-CMRP-575、Hela-pGL3-CMRP-589、Hela-pGL3-CMRP-614、Hela-pGL3-CMRP-632、Hela-pGL3-CMRP-654、Hela-pGL3-CMRP-675、Hela-pGL3-CMRP-789、Hela-pGL3-CMRP-819和Hela-pGL3-CMRP-1051的荧光素酶相对活性均与Hela-pGL3-Basic无显著差异；表明，CMRP、CMRP-575、CMRP-589、CMRP-614、CMRP-632、CMRP-654、CMRP-675、CMRP-789、CMRP-819和CMRP-1051在Hek293细胞与Hela细胞中均不具有启动子活性。C-pGL3-CMRP、Hek293-pGL3-CMRP与Hela-pGL3-CMRP的荧光素酶相对活性如图2所示。以上结果表明，CMRP、CMRP-575、CMRP-589、CMRP-614、CMRP-632、CMRP-654、CMRP-675、CMRP-789、CMRP-819和CMRP-1051的启动子活性均具有心肌细胞特异性。