技术领域本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及用于鉴定谷蠹的微卫星标记及引物。
背景技术：
谷蠹(RhizoperthadominicaFabricius)属鞘翅目(Coleoptera)长蠹科(Bostrichidae)昆虫。分布于世界各地，以热带和亚热带地区发生最严重，主要发生在澳洲、大洋洲、印度、阿拉伯半岛及我国的长江流域和华南湿热地区。其食性复杂，钻蛀危害，幼虫和成虫均可在粮粒内为害，主要有稻谷、大米、小麦、玉米、高粱、豆类、药材、干果、图书、皮草及革制品等，所蛀蚀的粮粒重量是自身重量的的5-6倍。谷蠹也可蛀食木材，并喜欢在木质内潜伏、化踊及越冬，严重破坏仓房的木质结构，是世界上最重要的仓储害虫之一。随着国际间或地区间粮食及食品贸易和流通日愈频繁，谷蠹的传播、扩散日趋严重。准确快速鉴定粮食及食品加工厂中的谷蠹是害虫防治的基础；同时掌握谷蠹的遗传变异水平，了解其进化过程，阐明其种群扩张与暴发机制，对预防与控制谷蠹的入侵具有重要理论与实践意义。微卫星分子标记可实现谷蠹的快速鉴定及遗传多样性研究，是农业害虫研究的重要分子标记工具。微卫星DNA(MicrosatellitesDNA)是核心序列为1-6个的寡核苷酸经多次重复形成的串联重复DNA序列，由核心序列和侧翼序列组成，核心序列呈串联状重复排列，侧翼序列位于核心序列两侧，是保守的特异单拷贝序列，具有物种特异性。微卫星DNA重复次数及重复程度的差异是造成每个基因座位多态性的原因，微卫星技术的关键是位点筛选和引物设计，根据微卫星DNA两端的保守序列设计特异性引物，才能扩增这个位点的微卫星DNA序列。微卫星标记具有分布广泛、多态性丰富、遗传共显性、容易检测以及重复性好等优点，是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、遗传多样性、种群遗传结构以及基因定位等方面的有效工具，被认为是当前种内遗传变异研究中分辨率最高、揭示能力最强的分子标记。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一组用于谷蠹鉴定及其遗传学分析的微卫星标记。该微卫星标记不仅可在粮食和食品储藏领域用于鉴定谷蠹，还对研究谷蠹种群遗传学，揭示其在我国及世界范围内的起源、入侵规律和扩散趋势等具有重要意义。本发明的第二个目的是提供一种用于谷蠹鉴定及其遗传学分析的试剂盒，该试剂盒包括针对本发明所述的微卫星位点设计的用于谷蠹鉴定及其遗传学分析的引物对。本发明的第三个目的是提供鉴定谷蠹的方法。为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：本发明提供一组用于谷蠹鉴定及其遗传学分析的微卫星标记，为RD1、RD3、RD4、RD5、RD6、RD7、RD8、RD10、RD11、RD12和RD14，具体地：RD1为SEQIDNo.1所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TC)18；RD3为SEQIDNo.2所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TG)7；RD4为SEQIDNo.3所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(CT)17；RD5为SEQIDNo.4所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TC)10；RD6为SEQIDNo.5所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TC)18；RD7为SEQIDNo.6所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TC)11；RD8为SEQIDNo.7所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(CT)20；RD10为SEQIDNo.8所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TC)8；RD11为SEQIDNo.9所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(GT)6；RD12为SEQIDNo.10所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(AC)9；RD14为SEQIDNo.11所示的DNA分子，其微卫星重复序列为(TG)8。本发明还提供了一种用于谷蠹鉴定及其遗传学分析的试剂盒，包括如下引物对：(1)RD1F：序列为SEQIDNo.12；RD1R：序列为SEQIDNo.13；(2)RD3F：序列为SEQIDNo.14；RD3R：序列为SEQIDNo.15；(3)RD4F：序列为SEQIDNo.16；RD4R：序列为SEQIDNo.17；(4)RD5F：序列为SEQIDNo.18；RD5R：序列为SEQIDNo.19；(5)RD6F：序列为SEQIDNo.20；RD6R：序列为SEQIDNo.21；(6)RD7F：序列为SEQIDNo.22；RD7R：序列为SEQIDNo.23；(7)RD8F：序列为SEQIDNo.24；RD8R：序列为SEQIDNo.25；(8)RD10F：序列为SEQIDNo.26；RD10R：序列为SEQIDNo.27；(9)RD11F：序列为SEQIDNo.28；RD11R：序列为SEQIDNo.29；(10)RD12F：序列为SEQIDNo.30；RD12R：序列为SEQIDNo.31；(11)RD14F：序列为SEQIDNo.32；RD14R：序列为SEQIDNo.33。上述微卫星分子标记或试剂盒鉴定谷蠹及对其进行遗传学分析的应用也属于本发明的保护范围。此外，本发明提供上述微卫星分子标记或试剂盒鉴定谷蠹的方法。具体地，一种方案如下：一种鉴定谷蠹的方法，包括如下步骤：检测待测储粮害虫的基因组中是否含有上述的微卫星分子标记，若含有上述微卫星分子标记中的至少一种，则判定所述待测储粮害虫为谷蠹，若不含有上述微卫星分子标记中的任一种，则判定所述待储粮害虫为非谷蠹害虫。另一种鉴定谷蠹的方法，包括如下步骤：用上述试剂盒中的引物对分别扩增待测储粮害虫，若上述试剂盒的11对引物中至少一对扩增得到PCR产物，则判定所述待测储粮害虫为谷蠹，若所述试剂盒的11对引物均没有扩增得到PCR产物，则判定所述待测储粮害虫为非谷蠹害虫。其中上述待测储粮害虫选自谷蠹RhizoperthadominicaFabricius、米象tophilusoryzaeLinnaeus、玉米象itophiluszeamaisMotschulsky、锯谷盗OryzaephilussurinamensisLinnaeus、赤拟谷盗TriboliumcastaneumHerbst、杂拟谷盗TriboliumconfusumJacquelinduVal、锈赤扁谷盗CryptolestesferrugineusStephens、长角扁谷盗CryptolestespusillusSchoenherr、土耳其扁谷盗CryptolestesturcicusGrouville、花斑皮蠹TrogodermavariabileBallion。本发明的有益效果如下：本发明首次构建了谷蠹微卫星文库，提供了11个谷蠹微卫星分子标记及扩增11个微卫星标记的引物序列和扩增方法，建立了微卫星快速鉴定谷蠹的技术体系，同时该发明提供的11对微卫星位点和引物对研究谷蠹种群遗传学，揭示其在我国及世界范围内的起源、入侵规律和扩散趋势等具有重要意义。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例1按照以下方法开发谷蠹微卫星分子标记：1.基因组DNA的提取、酶切和回收采用常规的酚-氯抽提法，提取10头谷蠹群体基因组DNA，取约800μg基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI进行消化，采用琼脂糖凝胶片断回收试剂盒回收300bp-1000bp的片段，将回收片段与由A:5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’；和B：5’-PO4-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’形成的接头连接。2.利用接头连接片段构建基因组PCR文库用连有接头的DNA片段作为模板，寡核苷酸链A作为引物，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。反应总体积为20μl，其中：2μl模板DNA，2μl10×buffer，2μlMgCl2，0.5μldNTP，20μM寡核苷酸链A，1UTaqDNA聚合酶；反应程序为94℃预变性3min；94℃40S，55℃40S，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收纯化片段大小在300bp～1000bp之间的带谱。3.磁珠富集谷蠹微卫星片段将上述2中回收的DNA片段和生物素标记的(CA)15探针进行杂交，45μl杂交体系中包括10μl回收的DNA片段，1.5μl探针(10μmol/L)，15μl20×SSC，0.5μl10％SDS，18μlddH2O，上述体系混合均匀，95℃处理10min后，68℃杂交1h。期间将100μl磁珠清洗后重悬浮于200μl杂交液中(6×SSC，0.1％SDS)，杂交结束后，将杂交反应液同磁珠混合，37℃温浴1小时。然后在室温条件下用200μl洗液(6×SSC，0.1％SDS)漂洗2次，每次5min；再用200ulTE在室温快速洗2次，加入50ulTE，95℃变性10min，释放出含有微卫星序列的单链DNA，迅速用磁力架吸出备用。PCR反应体系25ul：2μl磁珠富集DNA片段，20μM寡核苷酸链A，0.5μldNTP(2.5mM)，1UTaqDNA聚合酶，2.5μl10×buffer；PCR反应程序为：94℃预变性2min；之后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min，末次循环72℃延伸10min，4℃保存。琼脂搪凝胶检测PCR产物，产物集中在300-1000bp，并用试剂盒对PCR产物300-1000bp的带谱进行回收。4.DNA片段阳性克隆的筛选与测序将上述3中回收的DNA片段进行常规的克隆，运用PCR法筛选阳性克隆，取单克隆菌液2ul进行PCR检测，25ul体系，引物为T载体克隆位点两端的M13引物对和探针的寡核苷酸链(没有加生物素标记)，其它反应体系如3.中所述。反应程序为：95℃预变性5min；之后进行33个循环，每个循环包括94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s。末次循环72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物检测中如有2条或2条以上的条带，即表示该阳性克隆内含有微卫星的插入片段。将含有微卫星位点的阳性克隆委托生物技术公司进行双向测序。5.引物设计及检测运用软件SSRHunter1.3从获得的序列中寻找SSR位点，将获得的含有微卫星重复序列进行整理和编辑，选取重复数较为理想的微卫星序列，根据重复序列两侧的保守侧翼序列，用引物设计软件PrimerPremier5.0，设计微卫星位点引物。设计好的引物委托生物工程技术服务有限公司合成，初步PCR反应体系和条件为：反应体系为20μL：10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL，50-100ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积20μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃30s，54℃35s，72℃40s，35个循环，最后72℃延伸3min。最终获得14个微卫星分子标记分别为RD1、RD2、RD3、RD4、RD5、RD6、RD7、RD8、RD9、RD10、RD11、RD12、RD13和RD14。且11个微卫星分子标记对谷蠹均具有特异性，分别为RD1、RD3、RD4、RD5、RD6、RD7、RD8、RD10、RD11、RD12和RD14。实施例2一、微卫星分子标记的序列RD1为SEQIDNo.1所示的DNA分子；RD3为SEQIDNo.2所示的DNA分子；RD4为SEQIDNo.3所示的DNA分子；RD5为SEQIDNo.4所示的DNA分子；RD6为SEQIDNo.5所示的DNA分子；RD7为SEQIDNo.6所示的DNA分子；RD8为SEQIDNo.7所示的DNA分子；RD10为SEQIDNo.8所示的DNA分子；RD11为SEQIDNo.9所示的DNA分子；RD12为SEQIDNo.10所示的DNA分子；RD14为SEQIDNo.11所示的DNA分子。二、扩增微卫星分子标记的引物(1)RD1F：序列为SEQIDNo.12；RD1R：序列为SEQIDNo.13；(2)RD3F：序列为SEQIDNo.14；RD3R：序列为SEQIDNo.15；(3)RD4F：序列为SEQIDNo.16；RD4R：序列为SEQIDNo.17；(4)RD5F：序列为SEQIDNo.18；RD5R：序列为SEQIDNo.19；(5)RD6F：序列为SEQIDNo.20；RD6R：序列为SEQIDNo.21；(6)RD7F：序列为SEQIDNo.22；RD7R：序列为SEQIDNo.23；(7)RD8F：序列为SEQIDNo.24；RD8R：序列为SEQIDNo.25；(8)RD10F：序列为SEQIDNo.26；RD10R：序列为SEQIDNo.27；(9)RD11F：序列为SEQIDNo.28；RD11R：序列为SEQIDNo.29；(10)RD12F：序列为SEQIDNo.30；RD12R：序列为SEQIDNo.31；(11)RD14F：序列为SEQIDNo.32；RD14R：序列为SEQIDNo.33。三、利用微卫星分子标记鉴定谷蠹谷蠹RhizoperthadominicaFabricius、米象tophilusoryzaeLinnaeus、玉米象itophiluszeamaisMotschulsky、锯谷盗OryzaephilussurinamensisLinnaeus、赤拟谷盗TriboliumcastaneumHerbst、杂拟谷盗TriboliumconfusumJacquelinduVal、锈赤扁谷盗CryptolestesferrugineusStephens、长角扁谷盗CryptolestespusillusSchoenherr、土耳其扁谷盗CryptolestesturcicusGrouville、花斑皮蠹TrogodermavariabileBallion公众可以从国家粮食局科学研究院获得，提及以上品种的文献为：王殿轩,白旭光,周玉香,赵英杰.中国储粮昆虫图鉴.中国农业科学技术出版社，2008。1、实验样本21头常见储粮害虫样本均采集自我国不同地区，包括了10种鞘翅目害虫：谷蠹RhizoperthadominicaFabricius、米象tophilusoryzaeLinnaeus、玉米象itophiluszeamaisMotschulsky、锯谷盗OryzaephilussurinamensisLinnaeus、赤拟谷盗TriboliumcastaneumHerbst、杂拟谷盗TriboliumconfusumJacquelinduVal、锈赤扁谷盗CryptolestesferrugineusStephens、长角扁谷盗CryptolestespusillusSchoenherr、土耳其扁谷盗CryptolestesturcicusGrouville、花斑皮蠹TrogodermavariabileBallion。21头常见储粮害虫样本的具体信息见表1。表1本实施例中使用的储粮害虫样本2、基因组DNA的提取采用常规的酚-氯抽提法，分别提取21头常见储粮害虫基因组DNA。3、PCR扩增及检测利用上述获得的谷蠹微卫星引物分别对9种常见储粮害虫进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系为反应体系为20μL：10×Buffer2μL、10mMdNTPs0.4μL、10μMF-primer0.25μL、10μMR-primer0.25μL、5U/μLTaq酶0.2μL，50-100ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积20μl。扩增程序为：95℃预变性4min；94℃30s，54℃35s，72℃40s，35个循环，最后72℃延伸3min。4、结果和分析结果如表2所示，14对引物在谷蠹中均能得到扩增产物，其中有3对引物能在个别种中扩增出条带，11对在其余9种储粮害虫中均得不到扩增产物，表明这11对引物能将谷蠹与其它9种常见储粮害虫区分开来，是谷蠹的特异微卫星引物。表2谷蠹14对微卫星引物对10种储粮害虫的鉴定结果注：“-”，表示在该种储粮害虫中不产生目标条带；“+”，表示在该种储粮害虫中产生目标条带；“±”，表示在该种储粮害虫中个别样品产生条带。四、谷蠹微卫星分子标记遗传多态性研究通过上述开发出来的11对微卫星标记引物扩增60个谷蠹样本DNA，60个样本来自海南三亚粮库。经电泳检测、3730xl基因分析仪扫描分型，确定引物能在谷蠹样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星条带。根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，运用POPGENE1.31和CERVUS3.0分析观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、哈温平衡(HWE)、连锁平衡和多态信息含量(PIC)等遗传参数。结果如表3所示，通过对60个谷蠹遗传多样性检测发现，11对微卫星位点等位基因数在4-10之间，观测杂合度为0.233-0.800，期望杂合度为0.573-0.860，多态信息含量在0.460-0.864之间，多态信息含量丰富，是谷蠹种群遗传学研究的理想分子标记。表3谷蠹11对微卫星引物遗传多态性*，偏离HWEP＜0.05Bonferroni校正后显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。