本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是引起人类一系列感染性疾病的主要病原体之一，简称金葡菌，可引起皮肤感染、严重肺炎、心内膜炎、关节化脓性炎，和食物中毒，严重者可以引起中毒性休克综合征，极易导致患者致死亡。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcμ s aμ reμ s，MRSA)因其更为严重的耐药情况已成为院内外感染及耐药性监测中的重要病原体。MRSA具有耐药性的关键性原因是mecA基因。mecA基因存在于葡萄球菌的可移动性元件盒式染色体（Staphyloccoccal Cassette Chromosome mec，SCCmec）上。该可移动性元件还可以携带其他多种耐药基因、转座子、插入子等特殊结构在菌株之间进行水平转移，从而造成了菌株之间耐药基因的相互传播，引起菌株多重耐药。因此，mecA横向基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）是使许多敏感金葡菌获得耐药基因而转变为多耐药MRSA菌的重要途径。
目前，针对MRSA的新药的研究主要有以下方法，一是在原有抗生素的基础上改造结构探索新型抗生素，例如特拉万星（telavancin）就是通过对万古霉素的改造形成的万古霉素衍生物，并对MRSA具有良好的抗菌活性，但由于其对耐万古霉素金葡菌效果较差及其明显的毒副作用因此应用并不广泛；二是基于药物对金葡菌细胞壁高效的水解作用表现出的良好抗菌作用研制出的抗菌蛋白，该方法作用明显，特异性高，但是作为大分子蛋白质其在体内的代谢半衰期及其免疫原性的问题限制了其发展。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种特异性高、效果明显、无毒副作用的基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法，包括以下步骤：
（1）选择MRSA菌株对mecA基因编码转肽酶C末端的DNA序列进行PCR扩增；
（2）mecA基因凝胶回收；
（3）将步骤（2）所得的mecA基因与T-pMD19（simple）载体连接：
（4）制备DH5α感受态细胞；
（5）将步骤（3）所得产物电转DH5α感受态细胞
取100μl所述 DH5α感受态细胞置于冰上解冻；取11μl步骤（3）所得产物置于离心管中，将离心管和电转杯一起置于冰上预冷10min；将100μl解冻的所述 DH5α感受态细胞转移到上述离心管中，冰上混匀后，继续冰浴10min；
打开电转仪，将上述混合物转移至电转杯中，在2500V电压下进行电转，并将1ml 含有抗性的BHI 培养基迅速加入电转杯中，将其混匀后转移到10ml离心管中，37℃，250r/min 离心1.5h，进行复苏处理；取50μl上述混合物和50μl BHI培养基，混合均匀，然后涂在含有100μg/ml 氨苄西林的TSA平板上，置于37℃的保温箱内，过夜培养；
（6）T-pMD19-mecA质粒的提取与测序验证；
（7）T-pMD19-mecA质粒的双酶切处理和mecA基因的凝胶回收
T-pMD19-mecA质粒经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，进行凝胶电泳验证和mecA基因凝胶回收；
（8）pET-21a(+) 质粒的双酶切处理和凝胶回收
pET-21a(+) 质粒采用质粒DNA小量提取试剂盒回收后进行BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶双酶切处理后，进行凝胶回收；
（9）pET-21a(+) 质粒与mecA基因连接；
（10）oligos 的设计、合成、磷酸化及退火处理；
（11）pCas9∷mecA质粒的构建
pCas9凝胶回收产物与退火的双链oligos连接体系：pCas9凝胶回收产物12μl ，稀释后的oligos 1.5μl，T4连接酶1μl，T4连接酶buffer 2μl，双蒸水3.5μl；
连接条件：16℃下过夜连接，之后电转100μl DH5α感受态细胞，选择单克隆菌落提取pCas9∷mecA质粒；
（12）电转pET-21a(+)-mecA质粒到大肠杆菌表达菌株BL21（D3）中；
（13）电转pCas9∷mecA质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA感受态细菌中；
（14）电转pCas9∷mecA质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受态细菌中。
优选的，步骤（1）中所述PCR扩增过程中所需要的扩增引物为：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA 。
优选的，所述PCR扩增的体系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，扩增引物F 1μl，扩增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，双蒸水8.5 μl。
优选的，所述PCR扩增的过程是：
<1> 预变性：94℃下加热5分钟；
<2> 变性：94℃下加热30秒；
<3> 退火：50℃下加热30秒；
<4> 延伸：72℃下加热1分钟；
<5> 循环处理：循环<2>~<4>过程35次；
<6> 再延伸：72℃下继续延伸10分钟。
优选的，步骤（10）中所述磷酸化的条件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活。
优选的，步骤（10）中所述的退火处理为：加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 对中，然后将水浴锅加热到95℃后将体系放入，5分钟后关闭水浴锅电源，使其缓慢降温至50℃时，缓慢向水浴锅中添加冰水至温度降至室温。
优选的，所述质粒的提取过程是：选择单克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨苄西林的无菌BHI液体培养基中，进行增菌，然后提取质粒。
本试验过程中使用的细菌菌株及质粒来源：选择2014年6月~2014年12月收集的来自郑州市某综合医院临床标本，其中选MRSA mel-stap-a2014124 /zz菌株对mecA基因编码转肽酶的C末端的DNA序列进行PCR扩增，目的片段长度为1046bp；大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存；大肠杆菌BL21(D3)购自康为世纪有限公司；T载体（PMD-19 simple）购自大连的宝生物工程公司；pCas9质粒购自江苏吉瑞公司；pET-21a(+) 为本实验室保存；BsaI 内切酶购自NEB公司；T4 PNK 购自NEB公司；BamHⅠ和Hind Ⅲ 购自NEB公司；T4 DNA 连接酶购自NEB公司。
本试验过程中使用的主要试剂来源：溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）、氯霉素和TAE购自上海Solarbio公司，琼脂糖购自西班牙BIOWEST公司，Loading buffer购自碧云天生物技术有限公司，PH精密试纸购自天津市金达化学试剂厂，酵母浸粉、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，TSA培养基购自青岛海博生物技术有限公司，脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥技术有限责任公司，细菌质粒DNA小提试剂盒、微量DNA回收试剂盒、聚合酶链反应(PCR) 相关试剂、DL2000 DNA maker（DL2000及DL15000）和氨苄西林购自上海莱枫生物科技有限公司，氢氧化钠、氯化钠购自洛阳昊华化学试剂有限公司，琼脂粉购自Sigma公司，丙三醇购自天津市凯通化学有限公司，细菌基因组DNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，溶葡萄球菌酶购自SIGMA-ALDRICH。
本试验过程中使用的主要试剂的配制：
溶葡萄球菌酶缓冲液：将2mM EDTA和20mM Tris-HCl加到1.2% Triton中，用NaOH调节pH值至8.0，在121℃下灭菌20min，冷却至室温后，再加入溶葡萄球菌酶至浓度为200μg/mL，然后分装为180μl的小份，置于-20℃下保存备用。
1.5 %琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1.5g加入到100mL 1×TAE工作液体中，搅拌均匀后置于电炉上加热，直到液体沸腾后变为透明，冷却到56℃，再加入5μl EB，混合均匀备用。
25mg/ml 的氯霉素溶液：称取250mg氯霉素粉剂，加入到10ml 无水乙醇中混匀，使用22μm滤膜过滤，得到氯霉素溶液，分装为1ml的小份于-20℃下保存备用；使用时，将100ml LB、BHI、或BSA培养基置于121℃下灭菌20min，并降温至60 ℃，然后加入100μl上述所得氯霉素溶液，使最终工作浓度为25μg/ml。
100mg/ml 氨苄西林水溶液：称取1000 mg 氯霉素粉剂，加入到10ml去离子水中，混匀，使用22μm滤膜过滤，得到氨苄西林水溶液，分装为1ml的小份于-20℃下保存备用；使用时，将100ml LB、BHI、或BSA培养基置于121℃下灭菌20min，并降温至60 ℃，然后加入100μl上述所得氨苄西林水溶液， 使最终浓度为100ug/ml。
LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉和1.0g氯化钠溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调节pH值至7.2，并于121℃下灭菌20min，然后置于4℃下保存备用；使用时根据培养菌株所含电转质粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨苄西林抗生素溶液，混合均匀后使用。
LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化钠和1.5g琼脂粉，溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调节pH值至7.2，并于121℃下灭菌20min，冷却至50℃~60℃，使用时根据培养菌株所含电转质粒的抗性添加100ul上诉配置好的氯霉素或氨苄西林抗生素溶液倾注平板备用。
TSA培养基：称4g 购买的TSA培养基加入到100mL去离子水中，在121℃下灭菌20min，并降温至50℃~60℃，使用时根据电转质粒的抗性添加100ul上述配置好的氯霉素或氨苄西林抗生素溶液，混合均匀后倒入培养基平板，每板15ml，待晾干后置于4℃下保存备用。
BHI培养基：称取3.8g购买的BHI培养基加入到100mL去离子水中，在121℃下灭菌20min，降温至50℃~60℃，使用时根据电转质粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨苄西林抗生素溶液，混合均匀后备用。
1M 的NaCl：称取5.844g NaCl 到100mL 去离子水中，在21℃下灭菌20min，备用。
10%的甘油：取10mL丙三醇加入到80mL的去离子水中，定容至100ml，在21℃下灭菌20min，备用。
本试验过程中使用的主要仪器设备来源：
LabcyCler basic 梯度PCR仪购自 德国SensoQuest公司，JW-2017H高速离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司，HVE-50型自动电热压力蒸汽灭菌器购自日本Hirayama公司，海尔立式超低温保存箱购自青岛海尔股份有限公司，SK-1型快速混匀器购自 江苏金坛医疗仪器厂，隔水式电热恒温培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司，DYC31B型水平电泳槽购自北京市六一仪器厂，HH-42S数显恒温磁力搅拌循环水箱购自常州国华电器有限公司，ZD-85气浴恒温振荡器购自金坛市精达仪器制造有限公司，Gene pulser XCell 电转化仪购自Bio-Rad公司，微量可调节移液器购自美国Thermo公司，101-1B型电热鼓风干燥箱购自上海市实验仪器总厂，WD—9403C紫外仪购自北京六一仪器厂，Gene-Genius bioimaging system购自基因有限公司，DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂。
未作特别说明的试验材料和方法均为公知技术，可在常用工具书包括《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克、D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002）等中查找。
本发明的有益效果是：
本发明通过构建靶向mecA 基因的pCas9∷mecA 质粒及含有mecA 基因的大肠杆菌质粒pET-21a(+)-mecA 质粒，将前者电转入含有后者的大肠杆菌表达菌株中，从而实现清除mecA 所在质粒的目的。该方法操作简单，特异性强，针对类似于mecA 基因的传播方式，不仅可以消除MRSA菌株，同时可以预防敏感菌株接受mecA 基因后转变为MRSA菌株；同时较传统的基因编辑手段更为灵活，编辑效率更高。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
本发明提供的基于CRISPR/Cas9技术消除mecA 质粒的方法，包括以下步骤：
（1）DNA模板制备
使用细菌基因组DNA提取试剂盒从MRSA mel-stap-a2014124/zz菌株中提取DNA；
（2）mecA 基因PCR扩增
选择MRSA菌株对mecA 基因编码转肽酶C末端的DNA序列进行PCR扩增；
其中，扩增引物为：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA ；
PCR扩增的体系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，扩增引物F 1μl，扩增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，双蒸水8.5 μl；
PCR扩增的过程包括：
<1> 预变性：94℃下加热5分钟；
<2> 变性：94℃下加热30秒；
<3> 退火：50℃下加热30秒；
<4> 延伸：72℃下加热1分钟；
<5> 循环处理：循环<2>~<4>过程35次；
<6> 再延伸：72℃下继续延伸10分钟；
（3）mecA 基因凝胶回收
将40μL PCR体系加入到凝胶电泳的加样孔中，再加入DL2000 DNA marker，在90V电压下处理40分钟，然后放入WD—9403C紫外成像仪中，将上述所得物的对应1000bp 左右的条带迅速切割下来，切去多余的胶块，采用微量DNA快速回收试剂盒回收，并用双蒸MILLI-Q水洗脱，测量回收的DNA浓度，以便下一步连接实验计算载体和目的片段比例；
（4）将步骤（3）所得的mecA 基因与T-pMD19（simple）载体连接
连接体系包含：T-pMD19（simple） 载体1μl，mecA 基因5μl，连接Takara Buffer 5μl；将所得连接体系置于隔水式电热恒温培养箱中在16℃下的进行过夜连接；
（5）制备DH5α感受态细胞
将DH5α细菌接种到无抗性无菌的LB固体培养基内，在37℃下进行过夜培养；将5ml无抗生素的无菌BHI培养基装入到20ml灭菌玻璃试管内，选择DH5α细菌的单克隆菌落，接种到上述无抗生素的无菌BHI培养基内，在37℃下，以250r/min的速率振摇过夜，进行增菌；
将上述所得的DH5α细菌以1:100的比例加入到新的无菌无抗生素的BHI培养基中，在37℃下，以250r/min的速率振摇2.5小时，当细菌的OD值达到0.3~0.4时停止培养，置于冰上进行冰浴预冷，至菌液温度降至3℃~4℃；
将50ml离心管和10%甘油在在121℃下灭菌处理20min，并冷却至3℃~4℃，备用；将上述预冷过的菌液倒入离心管内，在4℃下以6000r/min的速率进行离心处理10min，除去上清液；再加入45ml预冷的MILLI-Q水，经枪头吹打混匀后，在4℃下以6000r/min的速率进行离心处理10min，除去上清液；重复该步骤一次；
再取45ml上述甘油置于离心管内，以6000r/min的速率在4℃下离心10分钟，弃上清；
冰上操作：在离心管中加入500μl 上述甘油，混匀，得到DH5α感受态细胞，置于-80℃的冰箱内保存备用；
（6）将步骤（4）所得产物电转DH5α感受态细胞
取100μl DH5α感受态细胞置于冰上解冻；取11μl步骤（4）所得产物置于1.5ml的离心管中，将离心管和0.2cm电转杯一起置于冰上预冷10min；将100μl解冻的感受态细胞转移到上述1.5ml离心管中，冰上混匀后，继续冰浴10min；
打开电转仪，将上述混合物转移至电转杯中，在2500V电压下进行电转，并将1ml 含有抗性的BHI 培养基迅速加入电转杯中，将其混匀后转移到10ml离心管中，37℃，250r/min 离心1.5h，进行复苏处理；取50μl上述混合物和50μl BHI培养基，混合均匀，然后涂在含有100μg/ml 氨苄西林的TSA平板上，置于37℃的保温箱内，过夜培养；
（7）T-pMD19-mecA 质粒的提取与测序验证
选择步骤（6）所得产物中的单克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨苄西林的无菌BHI液体培养基中，进行增菌，然后提取T-pMD19-mecA 质粒；
使用质粒DNA小量提取试剂盒，分两次每次收集1ml菌液，分别离心各1min，弃上清，枪头吸出残余菌液，中间步骤按照说明书进行，最后一步经MILLI-Q水洗脱及溶解，加水体积为每柱60μl，第一次洗脱液再次加入柱中进行第二次洗脱，以提高质粒DNA浓度；
（8）将提取的T-pMD19-mecA 质粒送至上海生工生物科技公司测序验证；
（9）T-pMD19-mecA 质粒的双酶切处理和mecA 基因的凝胶回收
T-pMD19-mecA 质粒在经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，进行凝胶电泳验证和mecA 基因凝胶回收；
酶切体系20μl：质粒DNA5μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶各1μl，Cutsmart buffer 2μl，双蒸水11μl；
将上述酶切体系在37℃下水浴4小时，完成T-pMD19-mecA 质粒的双酶切反应，再放入DYY-6C型电泳仪，90V下电泳40min，其中电泳介质为1.5%琼脂糖凝胶；mecA 基因凝胶回收过程与步骤（3）一致；
（10）pET-21a(+) 质粒的双酶切处理和凝胶回收
pET-21a(+) 质粒采用质粒DNA小量提取试剂盒回收后进行BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶双酶切处理后，进行凝胶回收；
酶切体系（20μl）：pET-21a(+) 质粒DNA 15μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶各1.5μl，Cutsmart buffer 2μl ；
酶切过程与步骤（10）一致，凝胶回收的过程与步骤（3）一致；
（11）pET-21a(+) 质粒与mecA 基因连接
pET-21a(+) 质粒双酶切后凝胶回收片段（10ng/μl），与步骤（9）中凝胶回收的mecA 基因 (12ng/μl)连接；
连接体系（32μl）：pET-21a(+) 质粒双酶切后凝胶回收片段20μl，凝胶回mecA 基因片段8μl，T4连接酶1μl，T4 连接酶buffer 3μl；
连接反应条件：将连接体系于16℃水浴下进行过夜连接，之后，电转300μl DH5α感受态细胞，选择单克隆菌落提取pET-21a(+)-mecA 质粒后送上海生工生物科技公司测序。
（12）oligos 的设计、合成、磷酸化及退火处理
利用sgRNAcas9 软件设计，挑选出6种对脱靶效率最低的oligos 序列，并参考文献中的两对oligos 序列，并参照oligos设计原则添加BsaI酶切位点后由上海生工生物科技公司合成。
oligos 磷酸化体系（50μl）： oligo I (100 μM) 1 μl，oligo II (100 μM) 1μl，10X T4 Ligase buffer (NEB) 5 μl， T4 PNK (NEB) 1 μl，ddH2O 42 μl；
去磷酸化条件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活；
Oligos 退火步骤：
加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 对中，然后将水浴锅加热到95℃后将体系放入，5分钟后关闭水浴锅电源，使其缓慢降温至50℃时，缓慢向水浴锅中添加冰水至温度降至室温；
Oligos序列见表1：
表1 Oligos序列
注：“F”代表正义链，“R”代表反义链。
（13）pCas9∷mecA 质粒的构建
pCas9质粒Bsal内切酶的酶切体系：pCas9质粒15μl，Bsal内切酶1μl，cutsmart buffer 2μl，双蒸水2μl；
酶切条件：37℃水浴3h，1.5%的琼脂糖凝胶电泳后凝胶回收；
pCas9凝胶回收产物与退火的双链oligos连接体系：pCas9凝胶回收产物12μl，稀释后的oligos 1.5μl，T4连接酶1μl，T4连接酶buffer 2μl，双蒸水3.5μl；
连接条件：16℃下过夜连接，之后，电转100μl DH5α感受态细胞，选择单克隆菌落提取质粒并送上海生工生物科技公司测序；
（14）电转pET-21a(+)-mecA 质粒到大肠杆菌表达菌株BL21（D3）中
采用步骤（7）的方法得到增菌液，将增菌液分为两份，其中一份菌液直接提取质粒进行单酶切，经过凝胶电泳验证细菌中是否具有质粒pET-21a(+)-mecA ，另一份直接制作感受态细胞；
（15）电转pCas9∷mecA 质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA 感受态细菌中
电转质粒pCas9∷mecA 和对照质粒pCas9 各2μl到100μl BL21（D3）+pET-21a(+)-mecA感受态细菌中；
取100μl上述菌液稀释10倍，再取10μl 稀释后的菌液涂布含有25μg/ml氯霉素的TSA平板，在37℃下过夜培养，并对平板上所有菌落进行计数编号；
在每个平板上随机选取10个菌落进行液体增菌，提取质粒；
所提取的质粒利用hind III酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳以判断Cas9质粒对pET-21a(+)-mecA 的作用；
（16）电转pCas9∷mecA 质粒和pCas9质粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受态细菌中
取100μl菌液稀释10倍，再取10μl 稀释后的菌液涂布含有25μg/ml的氯霉素的TSA平板，在37℃下过夜培养，并对平板上所有菌落进行计数编号；
在每个平板上随机选取10个菌落进行液体增菌，提取质粒；
所提取的质粒利用BamHⅠ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳以判断Cas9质粒对pET-21a(+)的作用。
9种不同Cas9质粒对pET-21a(+)-mecA 质粒和pET-21a(+)质粒的清除效率，如表2和表3：
由表2 可见，9种Cas9质粒对pET-21a(+)-mecA质粒的清除作用总体上存在差异，各组与对照组质粒pCas9的作用通过两两对比以后发现每次比较的P 值均为0.00小于调整后的检验水准α=0.006，因此除对照组pCas9质粒以外，剩余8组pCas9-mecA 质粒均对质粒pET-21a(+)-mecA 具有明显的清除作用。由表3可见包括对照组pCas9在内的90个菌落的检测结果均表明，PCas9-mecA 质粒对于不包含mecA 基因的pET-21a(+)质粒均没有消除作用。
表2 9种Cas9 质粒对pET-21a(+)-mecA 质粒消除作用效率
注：“*”为经Fisher 确切概率法双侧检验水准α=0.05，“^”因样本量小于40，故采用2×2四格表Fisher确切概率法，经双侧检验，校正后检验水准α=0.006。
表3 9种Cas9质粒对质粒pET-21a(+)消除作用效率
以上通过实施例对本发明的进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。