一种茄子抗黄萎病相关基因、获得方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学和农业领域，具体涉及一种茄子抗黄萎病相关基因、获得方法及其应用。

背景技术：

茄子(Solanum melongena L.)是我国重要蔬菜之一，营养丰富，经济效益较高，但大多数栽培茄易受黄萎病侵染。茄子黄萎病是由轮枝菌引起的一种土传性维管束病害，其症状通常表现为植株半边或叶片半边发黄、萎蔫，发病严重时劈开茎秆，可见维管束变褐。该病潜伏期长，传播能力强，为害范围广。发病严重时产量损失可达60％以上，美国、日本和印度都曾爆发茄子黄萎病，造成大面积减产。针对茄子黄萎病的防治，目前生产中多采用化学药剂、轮作等方法，但由于农药污染、经济成本等方面的矛盾，这些防治方法的实际应用效果不佳。

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是植物中普遍存在的一类核编码的铜离子蛋白，分为酪氨酸酶(单酚单氧化酶)、儿茶酚氧化酶(双酚氧化酶)和漆酶等三类。现有研究表明，多酚氧化酶是植物的一种重要防御酶类，如：Thipyapong等把马铃薯的PPO反义基因导入番茄中，发现表达反义基因后，转化植株多酚和咖啡酸的氧化降低了40倍，且反义基因的表达明显增加了植株对假单胞细菌的易感性^[1]；李保聚等利用抗病品种接种黄瓜黑星病菌后，发现叶组织中PPO活性迅速提高，且明显高于感病品种^[2]；此外，PPO活性与植物抗病性呈正相关性还被报道于对马铃薯、葡萄、棱角丝瓜、烟草等农作物PPOs基因的研究中^[3]-[5]。PPO的抗病机制主要是参与植物的次生代谢，产生毒性物质，如：O-醌等，直接毒杀病原菌；同时，O-醌还能继续聚合成黑色素的痂形成枯斑封闭感染的组织，防止病菌扩散，减少病原菌的营养物质，使病原菌得不到营养而死亡^[6]。

现有技术中，关于茄子黄萎病抗性与多酚氧化酶的研究主要集中在生理生化水平，例如，周宝利等研究了14个不同品种茄子在人工接种黄萎病菌悬液后的生理生化特性与抗病特性的关系，发现叶片PPO活性与抗病性极显著正相关^[7]。目前，只鉴定出茄子近缘野生种水茄(Solanum torvum Swartz)具有较强的抗黄萎病能力，几乎接近免疫的程度^[8]。然而，针对茄子多酚氧化酶与黄萎病抗性的研究尚未进入分子生物学水平。

参考文献

[1]Thipyapong P,Hunt MD,Steffens JC.Antisense down-regula-tion of polyphenol oxidase results in enhanced disease suscepti-bility.Planta,2004,220(1):103～117.

[2]李保聚,李凤云.黄瓜不同抗性品种感染黑星病菌后过氧化物酶和多酚氧化酶的变化[J].中国农业科学,1998,31(1):86-88.

[3]Constabel C P,Barbehenn R.Defensive roles of polyphenol oxidase in plants//Induced Plant Resistance to Herbivory.Springer Netherlands,2008:253-270.

[4]石雪晖,王淑英,吴艳纯,等.葡萄叶片中单宁、木质素、PPO活性与抗黑痘病的关系[J].中外葡萄与葡萄酒,1997,(4):8-11.

[5]谢文华,谢大森.棱角丝瓜不同品种对霜霉病抗性的相关研究[J].华南农业大学学报,1999,20(2):28-31.

[6]王曼玲，胡忠丽，周明全，宋运淳。植物多酚氧化酶的研究进展。2005，植物学通报，22(2)：215-222.

[7]周宝利，陈志霞，杜亮，叶雪凌，李宁。不同品种茄子抗黄萎病特性与生理生化指标及根际微环境指标的相关性分析，沈阳农业大学学报，2013-04,44(2):136-142.

[8]Collonnier C，Fock I，Kashyap V，Rotino G L，Daunay M C，Lian Y，Mariska I K，Rajam M V，Servaes A，Ducreux G，Sihachakr D.2001.Applications of biotechnology in eggplant.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，65(2)：91–107.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种茄子抗黄萎病相关基因以及其应用。本发明的发明理念为：充分利用分子育种的优势，从分子生物学方法的角度出发，利用RACE方法扩增、并对RACE产物测序、拼接，得到水茄StPPO1基因cDNA全长；随后，对其进行生物信息学分析、测定黄萎病菌接种后该基因的表达量变化，以进一步验证其功能，揭示该基因在黄萎病抗性中所发挥的作用，确定抗黄萎病基因。

为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种茄子抗黄萎病相关基因，其特征在于，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述的茄子抗黄蒌病相关基因是一条长度为2090bp的cDNA序列，命名为StPPO1。该基因5’UTR含110bp，3’UTR含180bp。该基因不含内含子结构，该结论与已报道的其它双子叶植物PPO基因结构一致。

该基因编码一种茄子抗黄萎病相关蛋白，所述的氨基酸序列共含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV三个保守结构域。蛋白结构方面，其CuA结合位点位于 202-219aa处，CuB结合位点位于367-378aa处。

本发明还提供了一种获得上述茄子抗黄萎病相关基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取水茄样本(如：四片真叶时期的根)总RNA和基因组DNA；

2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，得到水茄StPPO1基因cDNA全长，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：

3'-RACE引物GSP2：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’

5'-RACE引物GSP1：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；

3)以步骤1)中提取的水茄基因组DNA为模板，并且利用基于步骤2)中所得基因设计特异引物gP1F和gP1R，克隆StPPO1基因组全长，其中，所述的特异引物的核苷酸序列具体如下：

gP1F:5’-GCAATGGCAAGTGTGTGTGCAATAG-3’；

gP1R:5’-TTATTAGTGAATAACAACTCCAAG GAAATCAAG-3’；

4)对步骤3)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。

本发明还提供了如上所述的茄子抗黄萎病相关蛋白，以及编码上述茄子抗黄萎病相关蛋白的基因在茄子黄萎病的研究、植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良中的应用。本发明的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本基因为水茄中首次报道的黄萎病抗性相关多酚氧化酶基因，实验表明该基因响应水茄对黄萎病抗性的调控过程，该基因的克隆及研究对理解茄子抗黄萎病机制具有一定的参考价值；

2)该基因的获得既可作为茄子抗黄萎病分子标记辅助育种提供参考基因，也丰富了茄子等植物抗黄萎病转基因育种的基因选择，为茄子抗黄萎病分子育种奠定初步基础。

附图说明

图1是野生茄水茄根系RNA完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2是基因全长序列琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3是StPPO1基因序列。

图4是StPPO1保守区预测。

图5是StPPO1推导的氨基酸序列与栽培茄PPO同源序列的比对。

图6是StPPO1跨膜结构域预测。

图7是StPPO1的表达分析。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

实施例1：

本实施例1以野生茄水茄cDNA和基因组DNA为模板，使用RACE方法克隆了多酚氧化酶基因，具体步骤如下：

1)孢子悬浮液的制备：

茄子黄萎病菌经PDA培养基平板培养7天后，用解剖针从边缘挑取面积约1cm*1cm的菌丝块，移入PL培养液中，在摇床上以120rmp/min，25℃，震荡培养7-9天，此时PDA培养液(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)由透明液体变成乳白色液体。将乳白色液体用双层纱布过滤，保留滤液，用血球计数板观察孢子数，计算出每毫升孢子数量，用灭菌蒸馏水稀释病菌孢子，最终配成浓度为1x10⁷孢子/mL的孢子悬浮液，随即用于接种。

2)采用浸根接菌法接种：

从每个茄子品种中选取16株长势良好的幼苗，将幼苗拔起，用清水洗净根部，在幼苗根际1cm处断根，然后将根浸泡在茄子黄萎病病原菌孢子悬浮液(浓度1×10⁷个/mL)中15min，随后立即定植到新的4x8的穴盘中(穴盘中基质经高温蒸汽灭菌)。白天温度控制在25～28℃左右，夜间20～22℃左右，空气湿度60-90％。

分别取未接种前植株的叶片、茎段、根系和接种后6h、12h、24h、48h、96h植株的叶片、茎段、根系，经过液氮冷冻，-80℃保存。

3)提取总RNA与基因组DNA：

以水茄四片真叶时期的根为材料，提取水茄总RNA和基因组DNA。总RNA的提取参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤，cDNA的合成参照PrimeScript^TM RT reagent Kit说明书上的操作步骤，分装后直接用于PCR或置于-20℃冰箱保存。基因组DNA的提取参照TaKaRa植物基因组提取试剂盒操作说明。

4)引物设计与RACE扩增：

在引物设计方面，课题组前期利用表达谱测序筛选到部分响应黄萎病菌侵染的茄子基因 片段，结合表达水平差异、GO功能注释以及Pathway代谢通路等方面的分析，发现多酚氧化酶家族基因在茄子调控黄萎病胁迫过程中发挥了重要作用。因此，选择一条茄子多酚氧化酶基因序列片段为基础，利用Primer5引物设计软件设计特异引物，其核苷酸序列如下：

3'-RACE引物GSP2：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’(SEQ ID NO.2)

5'-RACE引物GSP1：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’(SEQ ID NO.3)；

通用引物UPM核苷酸序列：

长序列：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

短序列：CTAATACGAC TCACTATAGGGC。

其中，RACE的具体步骤包括：

a)PCR反应混合液的准备：

34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10X BD Advantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl 50X BD Advantage 2Polymerase Mix，总体积为41.5μl；

b)涡旋混合，短暂离心；

c)5'-RACE PCR反应，在0.5ml PCR管中按顺序加入所有成分，轻柔混合；

d)3'-RACE PCR反应，在0.5ml PCR管中按顺序加入所有成分，轻柔混合；

e)PCR反应条件：

5cycles：94℃30sec,72℃3min；5cycles：94℃30sec,70℃30sec,72℃3Min；20cycles(Poly A+RNA)：94℃30sec,68℃30sec,72℃3Min；

f)PCR产物的回收、测序与序列分析：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，利用TaKaRa MoniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit凝胶回收试剂盒回收目的片段。将其连接到pMD18-T上。16℃连接反应30分钟，转化到JM109感受态细胞中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，形成单菌落。随机挑选其中的白色菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基震荡过夜培养，利用载体通用引物M13(上海生工提供，M13F：5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'；M13R：5'-AAC AGC TAT GAC CAT)进行PCR扩增，以确认T载体中插入片段的有无及其长度大小，并随后进行测序、拼接，得到水茄StPPO1基因cDNA全长。

5)随后，以上述步骤3)中提取的水茄基因组DNA为模板，并且利用步骤4)中该基因设计引物gP1F和gP1R，克隆StPPO1基因组全长。

其中，设计的特异引物的核苷酸序列具体如下：

gP1F:5’-GCAATGGCAAGTGTGTGTGCAATAG-3’(SEQ ID NO.4)

gP1R:5’-TTATTAGTGAATAACAACTCCAAGGAAATCAAG-3’(SEQ ID NO.5)；

PCR扩增的总反应体系为25μL：包括2.5μL 10x buffer、2μL 2.5mM dNTP、1.25μL 10μM primer gP1F、1.25μL 10μM primer gP1R、2μL模板、0.2μL Taq酶和15.8μL ddH₂O。

PCR扩增的反应程序为：94℃4min预变性；94℃40s，50～56℃30s，72℃2min，共35个循环；72℃再延伸10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其检测结果见图1。图1显示18s和28s条带明亮，无5s条带，检测结果较好，可用于下一步实验。

实施例2：

本实施例中，对实施例1中克隆获得的水茄基因进行了分析和检测，且通过聚类分析和氨基酸比对确定该基因属于多酚氧化酶基因家族，与栽培茄中多酚氧化酶基因同源性较高；并且，利用半定量PCR分析表明其表达与水茄黄萎病抗性相关，进一步确认其功能。具体如下：

1)水茄StPPO1基因及其编码蛋白的生物信息学分析

通过RACE技术和电子克隆拼接获得一条cDNA序列，长度为2090bp的cDNA序列，命名为StPPO1。该基因5’UTR含110bp，3’UTR含180bp。该基因不含内含子结构，该结论与已报道的其它双子叶植物PPO基因结构一致。

通过ORF Finder结合BLAST X进行序列比对，推测StPPO1含一个1800bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)(图3灰色标注部分)，编码599个氨基酸，预测其等电点7.20，蛋白分子量约为67.33kD，该蛋白具有序列表中SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。利用targetp v1.1预测蛋白亚细胞定位。根据StPPO1cTP值为0.895的结果推测该基因均定位于叶绿体。利用Blastp对StPPO1氨基酸序列保守区进行预测(图4)，结果显示该序列共含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV三个保守结构域，推测该蛋白属于多酚氧化酶家族。ExPASy ScanProsite分析蛋白结构，StPPO1CuA结合位点位于202-219aa处，CuB结合位点位于367-378aa处(图5)，TMHMM预测跨膜结构域，结果显示氨基酸的跨膜螺旋预期数为6.16804，小于18(一般认为该数值大于18相应的氨基酸可能含有跨膜结构)，因此推测该蛋白不属于跨膜蛋白(图6)。

2)半定量分析

当幼苗长至四叶一心时，采用伤根法，将水茄根系浸没在黄萎病菌孢子悬浮液中15min，孢子浓度为5×107cfu/mL，此为实验组；清水作为对照组。处理后，取实验组接种前剪取的水茄根(C0)、接种黄萎病菌6h、12h、24h、48h、96h时剪取实验组的幼苗根系(T6、T12、T24、T48、T96)和对照组6h、12h、24h、48h、96h剪取的幼苗根系(C6、C12、C24、C48、C96)， 并将其经液氮速冻后于-80℃超低温冰箱中保存备用。重复3次。

随后，提取样品的总RNA，通过核酸蛋白测定仪测定RNA浓度和纯度。在逆转录之前，对所提取的总RNA浓度进行调整，使所要进行逆转录的RNA稀释到相同浓度，逆转录获得cDNA。以微管蛋白基因tublin为内参(因为该基因在茄子中表达稳定)，通过半定量PCR，检测了黄萎病菌侵染前后水茄根中StPPO1(图6)基因表达情况。

其中，根据Shetty等的研究(Santoshkumar M.Shetty,Arun Chandrashekar,Yeldur P.Venkatesh。Eggplant polyphenol oxidase multigene family:Cloning,phylogeny,expression analyses and immunolocalization in response to wounding。Phytochemistry72(2011)2275–2287)设计了内参引物，并且自行设计了半定量PCR引物，它们的核苷酸序列为：

tubulinF：5’-CTCATGTTCCGTGGTGATGT-3’；

tubulinR：5’-GAGAAGACCTCAGCAACACT-3’；

P1F：5’-TCCAGGAATGGGCACTATCG-3’；

P1R：5’-CCTCGCCGTTTGGTTGTCT-3’。

半定量PCR扩增的总反应体系为25μL：包括2.5μL 10x buffer、2μL 2.5mM dNTP、1.25μL10μM primer P1F、1.25μL 10μM primer P1R、2μL模板、0.2μL Taq酶(Taq polymerase)、和15.8μL ddH₂O。

半定量PCR程序为：94℃4min预变性；94℃40s，50～56℃30s，72℃2min，共35个循环；72℃再延伸10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

图7所示的结果表明，StPPO1基因在黄萎病菌侵染下表达量先升高，12h达到峰值，随后表达量下降，到96h时出现另一个峰值。但实验组在接种黄萎病处理的各时间段的StPPO1表达均高于对照组，这表明StPPO1参与了水茄抵御黄萎病的侵染过程。

本发明克隆得到的StPPO1基因不仅有助于揭示茄子与黄萎病菌之间相互作用的分子机制，为植物抗黄萎病代谢途径研究提供了重要的理论基础，也为植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良提供了有价值的候选功能基因。在应用方面，可以将本发明的StPPO1基因导入茄子等植物中，以期获得对黄萎病具有抗性的的转基因茄子，本发明的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护 范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。