本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与肺炎克雷伯氏菌耐药性密切相关的整合子。
背景技术：
医疗水平的进步，种类繁多的抗生素日益被开发出来并投放市场。大量应用于临床及兽医方面，甚至在畜牧业中，也常使用其促进生长，正是这些抗生素的广泛应用，尤其是不合理地使用，造成细菌的耐药以至多重耐药问题日益严重，耐药机制日趋复杂。人们预料可能由于基因突变会导致耐单种抗生素的菌株的出现，但在同一菌株中同时出现对多种抗生素的耐药性，很难用基因突变进行解释。研究证明，遗传物质在菌种内以及菌种间的水平传播，是细菌获得新的耐药性的重要途径。耐药性快速广泛地传播以及在不同菌种间出现非常相似的耐药方式，说明了上述机制的重要性。近来的研究表明整合子在耐药基因的水平传播以及多重耐药菌株的出现中起重要作用。
整合子(integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统。被其捕获和整合的细胞外游离基因或基因片段多为编码耐药性蛋白如β-内酰胺酶(β-lactamase)、氨基糖苷类钝化酶、林可霉素类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、大环内酯类钝化酶、氨基糖甙乙酰转移酶(AAC)、氨基糖甙磷酸转移酶(ANT)核苷转移酶(APH)等的耐药基因。
整合子在某些情况下通过捕获有利的基因盒，如耐药性基因盒，而获得生存优势，但也有可能捕获某些对宿主产生毒性的基因盒而造成不利的影响，或者过度捕获基因盒而对宿主菌的繁殖造成一定负担。因此，细菌的整合子在捕获外来基因盒的过程中，推测其一定有一套完整而又精细的调节机制，但这一机制还仍未明了。对上述有关调节机制的研究，将有利于揭示细菌的耐药性，尤其是细菌的多重耐药性。
技术实现要素：
本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In1290，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子含有aadA16基因盒、dfrA27基因盒、arr-3基因盒、catB3基因盒和aacA4基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的菌种对多种抗生素药物具有抗性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素、氯霉素类抗生素、大观霉素类抗生素以及利福平类抗生素。
常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。
常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰(SA)、以及复方新诺明(甲氧苄啶+磺胺甲恶唑)。
常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
常见的大观霉素类抗生素包括：大观霉素、观霉素、奇霉素。
常见的利福平类抗生素包括：利福平、利福喷汀。
本发明的整合子是通过以下方法获得的：
(1)在台州市立医院感染科病人血液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星、庆大霉素耐药的细菌；
(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯氏菌，将其命名为KP5325。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性；
(3)将KP5325菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒；
(4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度为5,238bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；
(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明提供了一种含有该整合子的菌株。该菌株命名为KP5325。KP5325菌株的质粒中含有整合子In1290，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种含有整合子In1290序列的重组质粒。所述质粒包含整合子In1290序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子In1290序列和pET32a载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知的常规方法。
本发明也提供了一种含有整合子In1290的接合菌株。为了研究整合子的耐药性，本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子In1290的功能，将KP5325菌株与E.coli J53 AzR(对叠氮化钠耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钠(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的抗性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替：妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素、利福平。
本发明还提供了一种含有整合子In1290的重组菌株。为进一步证实上述接合菌株的抗性来源于KP5325菌株中的整合子，本发明将该整合子In1290克隆入pET32a载体中，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E.coli JM109中，通过含有阿米卡星的平板选阳性克隆(含有pET32a-整合子的细菌)。将阳性克隆做药敏试验，结果显示KP5325菌株中的整合子In1290可以使重组E.coli JM109菌株对以下药物耐药：阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素、利福平、大观霉素。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO.1的包括多种耐药基因盒的整合子In1290，该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。
(2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
附图说明
图1为本发明的整合子In1290的结构示意图。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1整合子In1290的鉴定
1、KP5325菌株的分离和鉴定
1.1材料
细菌药敏卡：法国bio Merieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。
补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有复方新诺明(30μg)、氯霉素(30μg)和利福平(5μg)。
1.2方法
仪器鉴定：将台州市立医院感染科病人血液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO2孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏试验。
补充药敏试验：将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上复方新诺明、氯霉素和利福平纸片，在35℃含5％CO2孵育箱中培养16-18h后，按CLSI 2015标准鉴定药敏结果。
1.3结果
1.3.1仪器鉴定结果
中等大小的革兰氏阴性杆菌，KIA产酸/产酸，葡萄糖与乳糖产酸产气，氧化酶阴性，VP阳性，吲哚阴性，枸橼酸盐阳性，动力阴性，不产H2S，符合肺炎克雷伯菌的特性，经VITEK 2微生物分析仪鉴定为肺炎克雷伯氏菌，鉴定概率为99％，将其命名为KP5325。
1.3.2药敏实验结果
药敏实验结果表明，KP5325菌株对于以下药物产生抗性：阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、SMZ、氯霉素、利福平。
2、整合子In1290的分离和鉴定
2.1方法
2.1.1KP5325菌株的质粒提取
采用TaKaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为PCR模板，-20℃冰箱保存备用。
2.1.2整合子的获取
(1)将清洁干燥并经灭菌的0.5mL eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入KP5325质粒DNA 1μg和10×限制性内切酶反应缓冲液2μL(Fermentas)，再加入重蒸水使总体积为19μL，将管内溶液混匀后加入1μL BamHI酶液(Fermentas)，用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
(2)混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(插在泡沫塑料板上)，37℃水浴保温2-3h，使酶切反应完全。
(3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应。
(4)将酶切后的产物经过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
2.1.3整合子的鉴定
(1)将经琼脂糖凝胶电泳分离得到的长度为5,238bp的DNA片段回收。
(2)使用常规方法，将步骤(1)回收的DNA片段与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
2.2结果
测序结果进行分析和拼接后显示，长度为5,238bp的DNA片段属于I类整合子，该整合子包括I型整合子的基本结构和多个基因盒，序列如SEQ ID NO.1所示，结构示意图如图1所示。
实施例2质粒转导实验研究整合子In1290的功能
1、方法
(1)供体菌为KP5325菌株，受体菌为E.coli J53 AzR(对叠氮化钠耐药)。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35℃过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中，37℃220r/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5mL供、受体菌于4mL的LB肉汤中，37℃静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂(TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钠(300mg/L)和阿米沙星(0.06mg/L)。置35℃孵育18-24h。提取耐药菌株的质粒(步骤同实施例1)，以PCR法进行整合子In1290序列的检测。
扩增整合子In1290序列的引物如表1所示：
表1引物序列
PCR的反应体系(50μL)：Mg2+2.5mmol/L，引物30pmol/L，dNTP 0.2mmol/L，2.5U Tap酶及2μL DNA模板。
扩增条件：
94℃预变性3min，然后94℃变性1min，52-58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延长至10min。
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。将扩增产物的长度为5,238bp的DNA模板所在的菌株称为整合子In1290接合转移成功的阳性菌株。
(2)将阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。
1.2结果
药敏实验结果显示，整合子In1290序列表达阳性菌株的药敏反应同KP5325菌株相同，代表整合子In1290序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了下列药物的抗性：阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、SMZ、复方新诺明、氯霉素、利福平。
实施例3基因重组实验研究整合子In1290的功能
1、方法
(1)将实施例2中的PCR产物(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)与pMD19-T载体连接，连接产物加入100μL E.coli JM109的感受态中转化，在含有IPTG、x-gal、Amp的平板上培养，将IPTG、x-gal、Amp抗性菌株提取质粒测序(步骤同实施例1)，检测整合子In1290是否插入基因组中。然后将整合子In1290序列克隆到pET32a载体中，整合子的插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处，按照常规方法制备，得到含整合子In1290序列的pET32a重组质粒。将重组质粒转化到感受态E.coli JM109细胞中。
(2)对构建成功的克隆菌进行耐药性检测
采用法国bioMerieux的VITEK 2细菌鉴定及药敏分析系统和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)对重组菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1290)进行耐药性检测。
2、结果
药敏实验结果显示，重组菌E.coli JM109(pET32a-整合子In1290)的药敏反应同KP5325菌株相同，代表整合子In1290序列已经成功整合到E.coli JM109的基因组中，且该整合子导致了重组菌E.coli JM109产生了下列药物的抗性：阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、SMZ、复方新诺明、氯霉素、利福平。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。