一种新型整合子In1290的制作方法

文档序号:11804012阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种含有耐药基因盒的整合子,其特征在于,所述整合子序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组质粒,其特征在于,所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。

3.根据权利要求2所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒的制备过程中使用的载体质粒为pET32a载体。

4.一种接合细菌,其特征在于,所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述接合细菌是由KP5325菌株与E.coli J53 AzR菌株制备。

5.一种重组细菌,其特征在于,所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述重组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli JM109菌株中制备而成。

6.权利要求1所述的整合子的获取方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

(1)在台州市立医院感染科病人血液培养阳性的标本中分离出1株对阿米卡星、庆大霉素耐药的细菌;

(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验,经鉴定此菌株为肺炎克雷伯氏菌,将其命名为KP5325。同时,试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性;

(3)将KP5325菌株培养扩增,提取所述耐药菌株的质粒;

(4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切,琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度为5,238bp的DNA片段,将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接,然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中,以蓝白斑实验挑选阳性转化子,测序;

(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接,分析其结构,鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。

7.一种权利要求4所述的接合细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法的具体操作步骤如下:将KP5325菌株与E.coli J53 AzR菌株共培养,通过含有叠氮化钠和KP5325菌株耐受药物的平板筛选接合子。

8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述KP5325菌株耐受药物是阿米沙星。

9.一种权利要求5所述的重组细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法的具体操作步骤如下:将整合子In1290克隆入pET32a载体中,然后将重组质粒转化入野生型E.coli JM109中,通过含有阿米卡星的平板选阳性克隆。

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