EPHA2基因突变型及其应用的制作方法

本申请请求申请日为2015年5月19日，名称为“EPHA2基因突变型及其应用”的中国专利申请201510254801.5的优先权和权益，其完整内容通过参照在此并入。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的，本发明涉及突变检测领域，更具体的，本发明涉及一种突变型EPHA2基因、突变型EPHA2基因编码的多肽、突变型EPHA2基因和/或其编码的多肽的用途、筛查先天性白内障生物样本的方法、筛查先天性白内障生物样本的系统以及筛查先天性白内障生物样本的试剂盒。

背景技术：

白内障是由于各种原因如老化，遗传，局部营养障碍，免疫与代谢异常，外伤，中毒，辐射等，引起晶状体代谢紊乱，导致晶状体蛋白质变性而发生混浊，白内障的患者会发生视力下降，严重的可能会失明。白内障可以是先天性的，也可以是后天性的，先天性白内障多在出生前后即已存在，可伴有遗传性疾病，主要分为前极白内障，后极白内障，绕核性白内障及全白内障。

先天性白内障的发病率约为1-6/10000人[Apple DJ,Ram J,Foster A,Peng Q(2000)Elimination of cataract blindness:a global perspective entering the new millenium.Surv Ophthalmol 45Suppl 1:S1–196.]，是导致儿童期失明的重要因素，大约1/3的先天性白内障是遗传因素引起的，其遗传模式主要是常染色体显性遗传，也有一些隐性遗传和X连锁遗传的案例被报道[Huang B,He W.Molecular characteristics of inherited congenital cataracts.Eur J Med Genet 2010；53:347-57.]。白内障的发生可能与晶状体的透明度和折射率的改变、营养和细胞通讯，细胞结构、运动性、形状，晶状体发育异常等因素有关。先天性白内障有较高的遗传异质性，目前已报道的可导致先天性白内障的基因超过40个，EPHA2是其中的一个既有显性遗传模式又有隐性遗传模式的基因，EPHA2基因位于1号染色体短臂，由18个外显子组成，该基因在发育中起作用，特别是神经系统的发育，该基因上的一些突变已经报道会导致先天性白内障。虽然已经发现了40多个基因上很多突变会导致先天性白内障，但是仍有许多患者病因未明，对先天性白内障的研究仍有待深入。

技术实现要素：

本发明是基于发明人检测发现鉴定出先天性白内障致病基因的一个新的剪切位点突变而作出的。

依据本发明的第一方面，本发明提供一种突变型EPHA2基因，其具有SEQ ID NO：1所示的序列。根据本发明的一个实施例，所述SEQ ID NO：1所示的序列是分离出来的，其可以通过使野生型EPHA2基因产生c.2825+1G>A突变形成。检测该突变型基因，可以筛查出先天性白内障生物样本，可用于早期筛查先天性白内障致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗，也可用于先天性白内障患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，还可以用于先天性白内障治疗药物的制备开发。检测该突变型基因以检测筛查先天性白内障具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为先天性白内障的早期诊断、鉴别诊断及治疗药物的开发制备提供科学依据。

依据本发明的第二方面，本发明提供上述基因在先天性白内障的早期筛查、诊断和/或制备治疗先天性白内障药物中的用途。检测该突变型基因，可以筛查出先天性白内障生物样本，可用于早期筛查先天性白内障致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗，也可用于先天性白内障患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，还可以用于先天性白内障治疗药物的制备开发。检测该突变型基因以检测筛查先天性白内障具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为先天性白内障的早期诊断、鉴别诊断及治疗药物的开发制备提供科学依据。

依据本发明的第三方面，本发明提供上述任一基因编码的多肽。根据本发明的一个实施例，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。任选的，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是由于野生型EPHA2蛋白发生p.D942E*形成的。检测该突变型基因编码的多肽/蛋白，可以筛查出先天性白内障生物样本，可用于早期筛查先天性白内障致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗，也可用于先天性白内障患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，还可以用于先天性白内障的治疗药物的制备开发。检测该突变型基因编码的蛋白以检测筛查先天性白内障具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为先天性白内障的早期诊断、鉴别诊断及治疗药物的开发制备提供科学依据。

依据本发明的第四方面，本发明提供上述任一多肽在先天性白内障的早期筛查、诊断和/或制备治疗先天性白内障药物中的用途。

依据本发明的第五方面，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的方法，该方法包括以下步骤：获取所述生物样本的核酸；对所述核酸中的包含EPHA2基因的区域 进行序列测定，获得目标序列；将所述目标序列与上述任一突变型EPHA2基因进行比较，两者一致指示所述生物样本为先天性白内障生物样本。根据本发明的一个实施例，所述对核酸中的包含EPHA2基因的区域进行序列测定，获得目标序列，包括：利用引物扩增所述核酸，获得扩增产物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，对所述扩增产物进行序列测定，以获得目标序列。通过本发明这一方面或者任一实施例中的筛查先天性白内障的生物本品的方法，可以有效、高效地筛选出先天性白内障生物样本。

依据本发明的第六方面，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的系统，该系统用以实施上述本发明一方面或者任一实施例中的筛查方法的全部或部分步骤，该系统包括：核酸获取装置，用于获取所述生物样本的核酸；序列测定装置，与所述核酸获取装置相连，用于对所述核酸获取装置中的核酸中的包含EPHA2基因的区域进行序列测定，以获得目标序列；序列比较装置，与所述序列测定装置相连，用于将所述序列测定装置中的目标序列与上述本发明一方面中的突变型EPHA2基因进行比较，用以指示两者一致时的生物样本为先天性白内障生物样本。根据本发明的一个实施例，所述序列测定装置包含扩增单元，所述扩增单元与所述核酸获取装置相连，用以利用引物扩增所述核酸获取装置中的核酸，获得扩增产物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。通过本发明这一方面或者任一实施例中的筛查先天性白内障的生物本品的系统，可以有效、高效地筛选出先天性白内障生物样本。

依据本发明的第七方面，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的试剂盒，该试剂盒包括：适于检测上述本发明一方面任一实施例中的突变型EPHA2基因的试剂。试剂可以是探针、芯片、引物和/或突变型EPHA2基因的基因组DNA或cDNA的至少一部分，根据本发明的一个实施例，该试剂盒包括：序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物；任选的，该试剂盒还包括测序试剂。利用本发明这一方面或者任一实施例中的试剂盒，能够有效、高效地筛查出先天生物样品。

本发明的基因的新突变的发现检测利用了全外显子组测序技术，全外显子组测序技术是利用DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序的技术。相比于连锁定位和已知基因扫描，该技术更加方便、快捷、高效，特别是对于遗传异质性较高的疾病，有利于推动相关疾病诊断及治疗的研究进展。

本发明的基因的新突变的检测鉴定采用了新一代的全外显子组测序技术，基于对一个5代先天性白内障家系进行了全基因组外显子组测序分析，发现一个先天性白内障致病基因EPHA2的新的杂合突变。本发明鉴定出的新突变丰富了EPHA2基因的致病突变 图谱，进一步阐明了先天性白内障的分子发病机制，为先天性白内障的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的一个实施例中的筛查先天性白内障生物样本的方法的流程图。

图2是本发明的一个实施例中的筛查先天性白内障生物样本的方法的流程图。

图3是本发明的一个实施例中的筛查先天性白内障生物样本的系统的结构示意图。

图4是本发明的一个实施例中的筛查先天性白内障生物样本的系统的结构示意图。

图5是本发明的一个实施例中的家系图。

图6是本发明的一个实施例中的Sanger测序结果峰图。

图7是本发明的一个实施例中的Sanger测序结果峰图。

图8是本发明的一个实施例中的Sanger测序结果峰图。

图9是本发明的一个实施例中的Sanger测序结果峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的，本文中所使用的术语“第一”、“第二”或者“第一部分”等仅为方便描述，不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。在本文中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。

根据本发明的一个实施例，本发明提供一种突变型EPHA2基因，其具有SEQ ID NO：1所示的cDNA序列。野生型EPHA2基因的cDNA和蛋白质序列可从以下网址获得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi？REQUEST＝GV&DATA＝338422&BUILDS＝ALLBUILDS，EPHA2基因的突变型cDNA序列即SEQ ID NO：1显示如下——ATGGAGCTCCAGGCAGCCCGCGCCTGCTTCGCCCTGCTGTGGGGCTGTGCGCTGGCCGCGGCCGCGGCGGCGCAGGGCAAGGAAGTGGTACTGCTGGACTTTGCTGCAGCTGGAGGGGAGCTCGGCTGGCTCACACACCCGTATGGCAAAGGGTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAATGACATGCCGATCTACATGTACTCCGTGTGC AACGTGATGTCTGGCGACCAGGACAACTGGCTCCGCACCAACTGGGTGTACCGAGGAGAGGCTGAGCGTATCTTCATTGAGCTCAAGTTTACTGTACGTGACTGCAACAGCTTCCCTGGTGGCGCCAGCTCCTGCAAGGAGACTTTCAACCTCTACTATGCCGAGTCGGACCTGGACTACGGCACCAACTTCCAGAAGCGCCTGTTCACCAAGATTGACACCATTGCGCCCGATGAGATCACCGTCAGCAGCGACTTCGAGGCACGCCACGTGAAGCTGAACGTGGAGGAGCGCTCCGTGGGGCCGCTCACCCGCAAAGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGATATCGGTGCCTGTGTGGCGCTGCTCTCCGTCCGTGTCTACTACAAGAAGTGCCCCGAGCTGCTGCAGGGCCTGGCCCACTTCCCTGAGACCATCGCCGGCTCTGATGCACCTTCCCTGGCCACTGTGGCCGGCACCTGTGTGGACCATGCCGTGGTGCCACCGGGGGGTGAAGAGCCCCGTATGCACTGTGCAGTGGATGGCGAGTGGCTGGTGCCCATTGGGCAGTGCCTGTGCCAGGCAGGCTACGAGAAGGTGGAGGATGCCTGCCAGGCCTGCTCGCCTGGATTTTTTAAGTTTGAGGCATCTGAGAGCCCCTGCTTGGAGTGCCCTGAGCACACGCTGCCATCCCCTGAGGGTGCCACCTCCTGCGAGTGTGAGGAAGGCTTCTTCCGGGCACCTCAGGACCCAGCGTCGATGCCTTGCACACGACCCCCCTCCGCCCCACACTACCTCACAGCCGTGGGCATGGGTGCCAAGGTGGAGCTGCGCTGGACGCCCCCTCAGGACAGCGGGGGCCGCGAGGACATTGTCTACAGCGTCACCTGCGAACAGTGCTGGCCCGAGTCTGGGGAATGCGGGCCGTGTGAGGCCAGTGTGCGCTACTCGGAGCCTCCTCACGGACTGACCCGCACCAGTGTGACAGTGAGCGACCTGGAGCCCCACATGAACTACACCTTCACCGTGGAGGCCCGCAATGGCGTCTCAGGCCTGGTAACCAGCCGCAGCTTCCGTACTGCCAGTGTCAGCATCAACCAGACAGAGCCCCCCAAGGTGAGGCTGGAGGGCCGCAGCACCACCTCGCTTAGCGTCTCCTGGAGCATCCCCCCGCCGCAGCAGAGCCGAGTGTGGAAGTACGAGGTCACTTACCGCAAGAAGGGAGACTCCAACAGCTACAATGTGCGCCGCACCGAGGGTTTCTCCGTGACCCTGGACGACCTGGCCCCAGACACCACCTACCTGGTCCAGGTGCAGGCACTGACGCAGGAGGGCCAGGGGGCCGGCAGCAAGGTGCACGAATTCCAGACGCTGTCCCCGGAGGGATCTGGCAACTTGGCGGTGATTGGCGGCGTGGCTGTCGGTGTGGTCCTGCTTCTGGTGCTGGCAGGAGTTGGCTTCTTTATCCACCGCAGGAGGAAGAACCAGCGTGCCCGCCAGTCCCCGGAGGACGTTTACTTCTCCAAGTCAGAACAACTGAAGCCCCTGAAGACATACGTGGACCCCCACACATATGAGGACCCCAACCAGGCTGTGTTGAAGTTCACTACCGAGATCCATCCATCCTGTGTCACTCGGCAGAAGGTGATCGGAGCAGGAGAGTTTGGGGAGGTGTACAAGGGCATGCTGAAGACATCCTCGGGGAAGAAGGAGGTGCCGGTGGCCATCAAGACGCTGAAAGCCGGCTACACAGAGAAGCAGCGAGTGGACTTCCTCGGCGAGGCCGGCATCATGGGCCAGTTCAGCCACCACAACATCATCCGCCTAGAGGGCGTCATCTCCAAATACAAGCCCATGATGATCATCACTGAGTACATGGAGAATGGGGCCCTGGACAAGTTCCTTCGGGAGAAGGATGGCGAGTTCAGCGTGCTGCAGCTGGTGGGCATGCTGCGGGGCATCGCAGCTGGCATGAAGTACCTGGCCAACATGAACTATGTGCACCGTGACCTGGCTGCCCGCAACATCCTCGTCAACAGCAACCTGGTCTGCAAGGTGTCTGACTTTGGCCTGTCCCGCGTGCTGGAGGACGACCCCGAGGCCACCTACACCACCAGTGGCGGCAAGATCCCCATCCGCTGGACCGCCCCGGAGGCCATTTCCTACCGGAAGTTCACCTCTGCCAGCGACGTGTGGAGCTTTGGCATTGTCATGTGGGAGGTGATGACCTATGGCGAGCGGCCCTACTGGGAGTTGTCCAACCACGAGGTGATGAAAGCCATCAATGATGGCTTCCGGCTCCCCACACCCATGGACTGCCCCTCCGCCATCTACCAGCTCATGATGCAGTGCTGGCAGCAGGAGCGTGCCCGCCGCCCCAAGTTCGCTGACATCGTCAGCATCCTGGACAAGCTCATTCGTGCCCCTGACTCCCTCAAGACCCTGGCTGACTTTGACCCCCGCGTGTCTATCCGGCTCCCCAGCACGAGCGGCTCGGAGGGGGTGCCCTTCCGCACGGTGTCC GAGTGGCTGGAGTCCATCAAGATGCAGCAGTATACGGAGCACTTCATGGCGGCCGGCTACACTGCCATCGAGAAGGTGGTGCAGATGACCAACGAATAA。

根据本发明的一个实施例，所述SEQ ID NO：1所示的cDNA序列是由于野生型EPHA2基因发生c.2825+1G>A突变形成的。c.2825+1G>A表示野生型EPHA2基因cDNA序列的第2825位碱基后面1位内含子(内含子序列不出现在上述cDNA序列中)上的G突变成了A，造成了可变剪切，导致之后的cDNA序列发生了变化，即表现在上述cDNA序列中之后的106个碱基被ATAA(SEQ ID NO：1中加粗显示)四个碱基替代。

发明人通过检测分析发现，当在EPHA2基因突变型中出现c.2825+1G>A和/或p.D942E*突变时，检测生物样本的先天性白内障的效率更高。通过检测具有该突变的EPHA2基因突变型在生物样本中是否存在，可以准确有效地预测生物样本所属个体是否患有先天性白内障。需要说明的是，目前尚未有关于本发明提出的EPHA2基因的c.2825+1G>A突变导致先天性白内障的报道。

检测该突变型基因，可以筛查出先天性白内障生物样本，可用于早期筛查先天性白内障致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗，也可用于先天性白内障患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，还可以用于先天性白内障的治疗药物的开发。检测该突变型基因以检测筛查先天性白内障具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为先天性白内障的早期诊断、鉴别诊断及治疗药物的开发提供科学依据。

根据本发明的一些实施例，本发明提供上述突变型基因在先天性白内障的早期筛查、诊断和/或制备先天性白内障治疗药物中的用途。

根据本发明的一个实施例，本发明提供上述任一实施例中的突变型基因编码的多肽。

根据本发明的一个实施例，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。突变型EPHA2基因的氨基酸序列即SEQ ID NO：2显示如下——MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHR RRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNE。

根据本发明的一个实施例，所述SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是由于野生型EPHA2基因发生p.D942E*形成的。p.D942E*表示蛋白质序列(野生型编码的蛋白)第942位的天冬氨酸被谷氨酸(SEQ ID NO：2以粗体显示)替代，同时其后原有的氨基酸由于新的终止密码子的出现而提前终止翻译，造成了该蛋白质的截短。

发明人通过检测分析发现，当在EPHA2基因突变型中出现c.2825+1G>A和/或p.D942E*突变时，检测生物样本的先天性白内障的效率更高。通过检测具有该突变的EPHA2基因突变型在生物样本中是否存在，可以准确有效地预测生物样本所属个体是否患有先天性白内障。需要说明的是，目前尚未有关于本发明提出的EPHA2基因的c.2825+1G>A和/或p.D942E*突变导致先天性白内障的报道。

检测该突变型基因编码的多肽/蛋白，可以筛查出先天性白内障生物样本，可用于早期筛查先天性白内障致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗，也可用于先天性白内障患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，还可以用于先天性白内障的治疗药物的制备开发。检测该突变型基因编码的蛋白以检测筛查先天性白内障具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为先天性白内障的早期诊断、鉴别诊断及治疗药物的制备开发提供科学依据。

根据本发明的一些实施例，本发明提供上述任一实施例中的多肽在先天性白内障的早期筛查、诊断和/或治疗药物开发中的用途。

根据本发明的一个实施例，如图1所示，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的方法，该方法包括以下步骤：S10获取所述生物样本的核酸；S20对所述核酸中的包含EPHA2基因的区域进行序列测定，获得目标序列；S30将所述目标序列与上述任一突变型EPHA2基因进行比较，两者一致指示所述生物样本为先天性白内障生物样本。所称的两者一致指序列一致，特别指突变序列一致，例如，与野生型cDNA相比，二者的cDNA序列的第2825位碱基之后的106个碱基均为ATAA。

根据本发明的一个实施例，如图2所示，S20包括：S201利用引物扩增所述核酸，获得扩增产物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，S203对所述扩增产物进行序列测定，以获得目标序列。通过本发明的任一实施例中的筛查先天性白 内障的生物本品的方法，可以有效、高效地筛选出先天性白内障生物样本。

根据本发明的一个实施例，如图3所示，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的系统1000，该系统用以实施上述本发明一方面或者任一实施例中的筛查方法的全部或部分步骤，该系统包括：核酸获取装置100，用于获取所述生物样本的核酸；序列测定装置200，与所述核酸获取装置100相连，用于对所述核酸获取装置100中的核酸中的包含EPHA2基因的区域进行序列测定，以获得目标序列；序列比较装置300，与所述序列测定装置200相连，用于将所述序列测定装置200中的目标序列与上述本发明一方面中的突变型EPHA2基因进行比较，用以指示两者一致时的生物样本为先天性白内障生物样本。所称的两者一致指序列一致，特别指突变序列一致，例如，与野生型cDNA相比，二者的cDNA序列的第2825位碱基之后的106个碱基均为ATAA。

根据本发明的一个实施例，如图4所示，所述序列测定装置200包括：扩增单元210，所述扩增单元210与所述核酸获取装置100相连，用以利用引物扩增所述核酸获取装置100中的核酸，获得扩增产物，所述引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；以及测序单元220，所述测序单元220与所述扩增单元210相连，用以对所述扩增单元210中的扩增产物进行序列测定，以获得目标序列。通过本发明任一实施例中的筛查先天性白内障的生物本品的系统，可以有效、高效地筛选出先天性白内障生物样本。

根据本发明的一个实施例，本发明提供一种筛查先天性白内障生物样本的试剂盒，该试剂盒包括：适于检测上述本发明一方面任一实施例中的突变型EPHA2基因的试剂。试剂可以是探针、芯片、引物和/或突变型EPHA2基因的基因组DNA或cDNA的至少一部分，根据本发明的一个实施例，该试剂盒包括：如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列；任选的，该试剂盒还包括测序试剂。利用本发明任一实施例中的试剂盒，能够有效、高效地筛查出先天生物样品。

本发明的基因的新突变的发现检测利用了全外显子组测序技术，全外显子组测序技术是利用DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序的技术。相比于连锁定位和已知基因扫描，该技术更加方便、快捷、高效，特别是对于遗传异质性较高的疾病，有利于推动相关疾病诊断及治疗的研究进展。

本发明的基因的新突变的检测鉴定采用了新一代的全外显子组测序技术，基于对一个5代先天性白内障家系进行了全基因组外显子组测序分析，发现一个先天性白内障致病基因EPHA2的新的杂合突变。本发明鉴定出的新突变丰富了EPHA2基因的致病突变图谱，进一步阐明了先天性白内障的分子发病机制，为先天性白内障的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可通过常规市售获得。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例一

1.样本采集

发明人收集了一个中国安徽的先天性白内障家系，家系中的患者表现出先天性白内障的表型，呈常染色体显性遗传模式，家系图如图5所示，图中实心的表示患者、空心的表示正常人，II1、III11、IV2和IV8是测了外显子的样本。我们采集了该家系部分成员的外周血，并提取DNA，选取其中的4个成员(3个患者，1个正常人)进行外显子测序，所有提供血样的参与人员均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

2.芯片设计、文库构建和高通量测序

发明人用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0(NimbleGen,Madison,WI,USA)结合Solexa高通量测序技术对该家系中的4名成员的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)利用捕获芯片(NimbleGen SeqCap EZ Exome(44M))对基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。

2)将基因组DNA随机打断成200-300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

3)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与custom capture array进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为100bp。

3.变异检测、注释及与数据库比较

1)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7进行处理。然后过滤低质量reads和包含接头污染reads。使用Burrows–Wheeler Aligner(BWA)【H.Li and R.Durbin,Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform,Bioinformatics.,25(2009)1754-1760.】和Short Oligonucleotide Analysis Package(SOAPaligner 2.21)【R.Li,C.Yu,Y.Li,T.W.Lam,S.M.Yiu,K.Kristiansen,and J.Wang.SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment,Bioinformatics.,25(2009) 1966-1967.】将高质量reads比对到参考基因组(hg19)，获得比对到基因组上的唯一比对reads。然后对SOAP比对的结果用SOAPsnp1.05【R.Li,Y.Li,X.Fang,H.Yang,J.Wang,K.Kristiansen,and J.Wang,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing,Genome Res.,19(2009)1124-1132.】进行SNP的检测，对BWA比对的结果用Genome Analysis Tool Kit(GATK1.4)【M.A.DePristo,E.Banks,R.Poplin,K.V.Garimella,J.R.Maguire,C.Hartl,A.A.Philippakis,A.G.del,M.A.Rivas,M.Hanna,A.McKenna,T.J.Fennell,A.M.Kernytsky,A.Y.Sivachenko,K.Cibulskis,S.B.Gabriel,D.Altshuler,and M.J.Daly,A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data,Nat.Genet.,43(2011)491-498.】进行indel的检测。

2)对于检出的SNP和indel变异，我们进行注释，即确定变异所处基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。将检出的变异和dbSNP数据库、千人基因组数据库和ESP数据库等公共数据库进行了比较，保留了低频的变异(MAF≤0.01)。根据遗传模式(常染色体显性遗传)，选取了患者中为突变杂合而正常人为野生纯合的位点，基于上述过滤，我们对剩余的突变进行了已知基因的扫描，发现且仅发现EPHA2基因上有一个剪切位点突变，我们对该突变进行了Sanger验证，4个成员的样本的Sanger验证结果如图6所示。

3)通过以上分析，我们在患者的EPHA2基因上发现了未报道过的杂合突变c.2825+1G>A,p.D942E*，该突变在患者中是突变杂合，在正常人中是野生纯合，我们后续对家系中其他成员的该位点进行了sanger验证，该家系的其他成员的Sanger验证结果如图7-9所示，结果证明了该突变在家系中与疾病共分离。同时该突变在我们之前用同样的外显子捕获探针测序的1000个外显子数据库中不存在。

突变说明：

c.2825+1G>A：cDNA第2825位碱基后面1位内含子(内含子序列不出现在cDNA序列中)上的G突变成了A，造成了可变剪切，导致之后的cDNA序列发生了很大变化(在此例中，导致之后的106个碱基被ATAA四个碱基替代)。

p.D942E*：蛋白质序列第942位的天冬氨酸被谷氨酸替代，同时其后原有的氨基酸由于新的终止密码子的出现而提前终止翻译，造成了蛋白质的截短。

实施例二

1.样本制备

采集家系中成员外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280 均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。

2.疾病突变位点检测

分别对家系内测了外显子的3个患者样本和1个正常样本以及其他愿意捐赠样本的家系成员进行Sanger测序，包括引物设计，PCR扩增，产物纯化，测序得到序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证突变与先天性白内障之间的相关性。具体方法步骤如下：

1)DNA提取：

分别对参与研究人员的外周静脉血按照实施例一的方法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量。

2)引物设计及PCR反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体见下。

a)引物序列：

正向引物：5'-CGGCACATAGCCCTCAGTAA-3'(SEQ ID NO：3)

反向引物：5'-GAGGGGCAGCAGTAGTTACA-3'(SEQ ID NO：4)

b)反应体系：25μL

c)反应条件：

3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABI的3730进行DNA测序。

在该家系中，患者均为致病突变的突变杂合体，正常人均为野生纯合体。因此我们 认为EPHA2基因上的c.2825+1G>A突变为先天性白内障的一个致病突变。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。