一种基于锚定‑粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于锚定-粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法。

背景技术：

天然酶是生产实践中最高效的温和催化剂，对人们的日常生活具有非常重要的意义。当天然酶被提取出来应用于生产实践中时，它的稳定性变差导致容易失活，而且不能够再重复利用。因此人们将酶在载体表面进行固定化，这样可以克服天然酶存在的不足，还保留天然酶的高效性、高选择性等优点，有利于工业生产中的连续操作。因此固定化酶技术成为酶工程研究领域中的热点和重点对象。

目前传统固定化酶技术已经有了重大突破以及取得了很多的重要的成果，然而在传统常见的固定化酶技术中酶分子一般是多个位点与载体进行结合，这样很容易导致酶分子的催化活性中心被载体阻挡，同时固定化酶的数量少，这些最终导致酶催化活性效率下降。为了克服存在的这种问题，越来越多的人开始探索研究新的固定化方法和寻找新的固定化载体，尽可能保证固定化酶的催化活性中心不受破坏，同时提高固定酶的数量。

纤维素是自然界中最为丰富的、可再生的天然高分子聚合物，其中微晶纤维素由于具有高稳定性、比表面积大、生物安全性好、价格便宜等特点成为了一种性能优良的生物材料，因此对纤维素的高附加值利用已经变成了一个研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有固定化技术存在的固定化酶数量少和固定化酶蛋白分子活性中心被隐藏等不足，通过基因工程技术手段改造固定化蛋白质使其按照同一方向固定在纤维素表面，保证该蛋白活性中心在固定化之后的完整性。在本发明中引入支架蛋白作为载体与固定化蛋白之间的桥梁，通过控制支架蛋白长度来间接调控固定蛋白质的数量，最终实现蛋白质多层定向固定化。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1、一种基于锚定-粘合机制的蛋白质多层定向固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)支架蛋白与固定化蛋白质的结构设计、分子改造和生物制备，具体包括：

①支架蛋白与固定化蛋白质的结构和功能设计：支架蛋白由1-12个粘合域结构组成而且没有催化活性；固定化蛋白质碳末端添加锚定域结构，使得能够亲和识别粘合域。

②锚定域基因与粘合域基因的分子克隆。

③拼接1-12个不同数量的锚定域基因构成了不同长度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纤维素结合域CBM基因和氮末端添加组氨酸标签，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞内表达验证以及支架蛋白的分离纯化。

⑤固定化蛋白质的基因修饰，即在该蛋白氮末端插入锚定域基因构建新的融合蛋白，为了保证该融合蛋白的可溶性表达因此在固定化蛋白和锚定域中间插入GS-Linker短肽，最后是固定化蛋白质的微生物胞外分泌表达以及其验证该融合蛋白是否与支架蛋白发生特异性亲和吸附作用。

(2)固定化前对载体进行表面封闭处理，目的是封闭载体表面微孔隙防止支架蛋白的非特异性吸附。具体操作是将载体分散在质量浓度为1％牛血清蛋白溶液中，在20℃条件下振荡1h，然后离心除去上清液，并用pH 8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。

(3)支架蛋白与载体的亲和吸附，形成载体-支架蛋白自组装体。具体操作是将表达纯化后不同长度的支架蛋白与封闭处理后的载体在20℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。

(4)固定化蛋白与载体-支架蛋白的亲和固定吸附，最终进行多蛋白的自组装体系。具体操作是将载体-支架蛋白与表达纯化后的固定化蛋白质在4℃条件下进行振荡混合12h，并且添加终浓度为10mM的氯化钙促进固定化蛋白质的吸附，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。

进一步，所述步骤(1)中支架蛋白由纤维素结合域CBM和粘合域组成，而且该支架蛋白长度范围为1-12个粘合域。

进一步，所述步骤(1)中固定化蛋白质基因后面连接锚定域，而且该蛋白基因与锚定域中间由基因长度为21pb的GS-linker短肽连接。

进一步，所述步骤(1)中支架蛋白与固定化蛋白均带有组氨酸标签，通过蛋白的组氨酸标签与金属镍进行亲和吸附作用除去杂蛋白。

进一步，所述步骤(2)中的载体材料为纤维素。

进一步，所述步骤(3)中支架蛋白与载体进行反应的固液质量比为1:20，固定化温度为20℃。

进一步，所述步骤(4)中固定化蛋白与载体的固液质量比为1:40，固定化温度为4℃，而且必须要添加终浓度10mM的氯化钙促进固定化吸附作用。

在本发明的一方面，提供一种支架蛋白的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)种属和类型特异性的锚定域基因与粘合域基因的分子克隆

(2)不同长度支架蛋白的粘合域基因之间柔性分子拼接

(3)碳端引入纤维素结合域，氮端添加组氨酸标签

(4)支架蛋白的可溶性胞内表达以及分离纯化

步骤(1)具体为：粘合域与纤维结合域基因原始序列来源于热纤梭菌，因此设计引物以该模板进行PCR扩增获得粘合域与纤维素结合域构基因。

步骤(2)具体为：通过双酶切手段把扩增获得的粘合域基因有序的进行不同长度的拼接，插入到pET22b质粒中。

步骤(3)具体为：通过酶切手段在该支架蛋白的碳端插入纤维素结合域，同时在氮端添加了组氨酸标签。

步骤(4)具体为：将构建完毕的pET22b质粒导入到BL21中进行蛋白的可溶性验证，利用组氨酸标签对该蛋白进行纯化。

在本发明的另一方面，提供一种固定化蛋白的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)种属和类型特异性的锚定域基因的分子克隆

(2)固定化蛋白基因与特定锚定域基因的柔性分子对接

(3)固定化蛋白氮端引入基因长度为21pb的GS-Linker短肽

(4)固定化蛋白的可溶性表达以及分离纯化

步骤(1)具体为：锚定域基因原始序列来源于热纤梭菌，因此设计引物以该模板进行PCR扩增获得锚定域基因。

步骤(2)具体为：将扩增的锚定域基因插入到PYD质粒的GS-Linker短肽后面，然后接着在GS-Linker短肽前面插入固定化蛋白质基因，最后将这构建的所有基因进行PCR扩增，插入到PETDuet质粒中。

步骤(3)具体为：将构建完毕的PETDuet质粒导入到BL21中进行蛋白的可溶性验证，利用组氨酸标签对该蛋白进行纯化。

本发明的有益效果：

本课题借助基因重组技术手段，构建了一套完整的多层定向自主装固定化蛋白体系，体系中引入支架蛋白作为固定载体与固定目标蛋白之间的桥梁，这样提高了固定化蛋白复合体系的生物相容性，一方面可以使得支架蛋白与固定化蛋白质特异性定向结合，从而克服了传统固定化蛋白中催化活性位点被隐藏的缺点，另一方面通过可控性调节支架蛋白的长短来间接控制固定目标蛋白的数量，这种方法固定的蛋白质数量远远大于传统单层固定化蛋白的数量。

附图说明

图1支架蛋白发酵液蛋白电泳图

图2支架蛋白发酵液纯化后蛋白电泳图

图3绿色荧光蛋白GFP纯化后蛋白电泳图

图4纤维素吸附支架蛋白及GFP复合体电泳图

图5固定化载体纤维素荧光显微镜图片

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆：实验室操作手册中所述的条件或者按照说明书所建议的条件。

实施例1支架蛋白的制备

一、支架蛋白质粒材料：

用于克隆的大肠杆菌为E.coli TOP10，用于目的基因表达菌株为E.coli BL21(DE3)，均从天根生化科技(北京)有限公司购买。

二、支架蛋白表达质粒的构建：

根据已知粘合域基因序列，用合成方法得到两种脱氧核糖核苷酸链olpb-1-NdeI-F和olpb-1-NcoI-R，以上引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成，然后以这两种脱氧核糖核苷酸链为引物，以热纤梭菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到一条522pb的DNA分子，用琼脂糖凝胶电泳检测并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，将该回收的目的基因DNA和质粒pET22b由NdeI和NcoI限制性内切酶进行双酶切，再通过PCR回收试剂盒进行纯化回收，将两者的回收产物用T4连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒pET22b-olpb-1，并将重组质粒转入Top10感受态细胞中进行重组质粒的扩增以及序列验证。同理上述相同的实验方法，使用olpb-2-NcoI-F和olpb-2-BamHI-R这对引物构建得到质粒pET22b-olpb-2，使用olpb-3-BamHI-F和olpb-3-EcoRI-R这对引物构建得到质粒pET22b-olpb-3，使用olpb-4-EcoRI-F和olpb-4-SalI-R这对引物构建得到质粒pET22b-olpb-4，使用olpb-5-SalI-F和olpb-5-HindIII-R这对引物构建得到质粒pET22b-olpb-5，使用olpb-6-HindIII-F和olpb-6-NotI-R这对引物构建得到质粒pET22b-olpb-6，最终构建出六种不同长度的支架蛋白质粒。此外使用CBM-NdeI-F和CBM-NdeI-R这对引物扩增纤维素结合域CBM基因，然后在这六个支架蛋白质粒的NotI/XhoI的酶切位点插入纤维素结合域CBM基因，目的是使得支架蛋白能够特异性的结合在纤维素表面，最后把这六种构建完毕的支架蛋白质粒导入到大肠杆菌BL21中进行表达，最后挑取测序正确的单菌落进行甘油管保存该菌种。本实验实际一共构建了1-12种不同长度的支架蛋白，最后发现随着支架蛋白分子量的增加目标蛋白会越难以表达，此外支架长度过长容易导致固定化蛋白进行固定化时传质效果下降，经过实验探索发现1-6长度的支架蛋白固定化效率最高，因此选择1-6长度的支架蛋白作为本发明实验对象。

三、支架蛋白表达：

将保藏的支架蛋白甘油管进行活化，即在超净台中取菌液，以1/1000接种量接种至4ml LB液体培养基，并在培养基中加入抗性氨苄青霉素，加入量为培养基体积的1/1000，在37℃、180rpm摇床培养12h。用250mL摇瓶配50mL的液体LB培养基，并用高温灭菌锅灭菌。等待灭菌培养基灭菌冷却后，然后从上述培养的4ml LB试管中取出菌液以1％的接种量接种到250ml摇瓶中，同理加入培养基体积1/1000的氨苄青霉素，放在37℃摇床培养，当培养OD600nm为0.6时大肠杆菌处于对数生长期，此时在无菌操作环境下加入培养基体积2/1000的诱导剂IPTG(终浓度为0.2mM)，继续过夜20℃培养。

发酵培养结束后，测定发酵液的OD值，然后将发酵的菌液在7000rpm、5min的条件下离心，用去离子水重悬离心得到的菌体后再次以相同的条件离心。然后计算浓缩OD为20时该加入的PH8.0tris-Hcl缓冲液的体积，加入缓冲液后将菌体重悬后进行4℃超声破胞，条件为间隔3s、运行3s、工作次数90次，功率在120-160w之间，然后在13000rpm、4℃条件下离心该菌体破胞液10min，收集上清液，最后将该上清液跑SDS-PAGE蛋白电泳，验证支架蛋白的表达效果(见图1)，比对发现蛋白电泳图中支架蛋白目标条带位置与理论值大小相符合，其中olpb-1蛋白量分子大小为45.0kD，olpb-2蛋白量分子大小为64.6kD，olpb-3蛋白量分子大小为84.2kD，olpb-4蛋白量分子大小为103.8kD，olpb-5蛋白量分子大小为123.4kD，olpb-6蛋白量分子大小为143.0kD。

在支架蛋白进行发酵表达的时候，除了目的蛋白以外还会有少量的其它杂蛋白同时表达，为了除去杂蛋白，对上述破胞离心后的发酵液进行纯化，利用支架蛋白上的组氨酸标签与镍金属结合的原理进行过镍柱纯化，跑蛋白电泳SDS-PAGE验证纯化效果(见图2)，通过与图1比对可看出纯化效果良好。

实施例2固定化蛋白质的制备

一、固定化蛋白质质粒材料：

使用的PYD质粒来源于实验室保藏，用于克隆的大肠杆菌E.coli TOP10由天根生化科技(北京)有限公司提供，用于目的基因表达菌株为E.coli BL21(DE3)，从天根生化科技(北京)有限公司购买。

二、固定化蛋白质表达质粒的构建

本发明使用了绿色荧光蛋白GFP作为固定化蛋白质，利用设计的引物docCipA-NheI-F和docCipA-NheI-R从热纤梭菌中扩增锚定域docCipA基因，对载体PYD与锚定域docCipA基因进行单酶切NheI处理，在16℃进行连接过夜然后导入到大肠杆菌Top10中进行质粒的扩增，筛选阳性重组子并进行测序验证，保藏正确的菌种进行下一步验证。利用GFP-HindIII-F和GFP-HindIII-R这对引物扩增GFP基因，然后在上述构建正确质粒的HindIII酶切位点处插入GFP基因。最后设计引物GFP-GSlinker-docCipA-SacI-F和GFP-GSlinker-docCipA-SacI-R将GFP-GSlinker-docCipA这段基因扩增，对该扩增的基因与PETDuet载体进行SacI单酶切处理，同理在16℃进行连接过夜然后导入到大肠杆菌BL21中，筛选阳性重组子并进行测序验证，保藏正确的菌种。

三、固定化蛋白质的表达：

表达固定化蛋白质GFP的方法与表达支架蛋白的方法相同，同理对GFP进行镍柱纯化处理，出去表达的杂蛋白，跑蛋白电泳SDS-PAGE验证结果(图3)，比对发现固定化蛋白质条带位置与理论GFP蛋白大小48.2kD大小相符。

实施例3蛋白质复合体多层定向固定化实验

一、蛋白质多层定向固定化原理

本发明选取微晶纤维素作为固定化蛋白质的载体，同时选取绿色荧光蛋白GFP作为固定化蛋白质，这样可以通过检测GFP荧光来表征固定化情况。本发明中支架蛋白通过其末端的纤维素结合域CBM与载体微晶纤维素发生作用力很强的亲和固定，然后绿色荧光蛋白GFP通过其末端的锚定域docCipA与支架蛋白上的粘合域olpb再进行亲和吸附固定化，最终实现了纤维素载体、支架蛋白以及绿色荧光蛋白三者之间的多层定向自组装。

二、蛋白质复合体多层定向固定化实验

实验首先使用质量浓度为1％牛血清蛋白BSA封闭处理微晶纤维素表面微孔，在20℃条件下振荡1h，防止目标蛋白和微晶纤维素发生非特异性吸附，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。接着将表达纯化后六种长度的支架蛋白与处理后的纤维素在20℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次。最后将吸附了支架的纤维素与表达纯化后的固定化蛋白质GFP在4℃条件下进行振荡混合12h，然后离心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次，取一部分固定化后的纤维素载体跑蛋白电泳SDS-PAGE(图4)，电泳结果发现纤维素能够固定不同长度的支架蛋白，而且均能够固定GFP，这说明蛋白质复合体固定化效果良好。此外，设置对比实验使纤维素与GFP进行混合反应，用ph 8.0Tris-Hcl缓冲液洗涤三次，然后使用荧光显微镜观察该固定化后的纤维素载体(图5)，结果发现无支架蛋白的对照组基本没有荧光，有支架蛋白的实验组都有荧光，而且随着支架蛋白长度增加后固定的GFP越多荧光量也跟着越强。