本发明涉及一种冰法提取植物冰结构蛋白的方法。
背景技术：
冰结构蛋白(ice structuring proteins,ISPs)，又称为不冻蛋白、抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)，是一类由某些鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌为抵抗外界环境应激反应所产生的多肽，具有阻止冰晶形成、修饰冰晶形态及抑制重结晶的能力，它具有一定的热滞活性，即能够以非依数性形式降低溶液的冰点，但对熔点的影响较小，从而使溶液的冰点与熔点之间出现差值。冰结构蛋白特有的性质保证生物在低温条件下得以生存。2006年，我国卫生部公布冰结构蛋白可作为新型食品添加剂应用于冷藏食品中。
由于提取ISPs原料有限，大多从冷水鱼中提取，提取工艺复杂等因素，造成其成本较高、价格昂贵，没有在冷冻食品中及医学上普遍应用，对ISPs的发展造成了限制。如何制造出提取简单、价格低廉的ISPs发展的主要任务。植物ISPs的结构与功能较为复杂，具有低热滞性(大多约0.1～0.5℃)和高重结晶抑制活性(高出鱼类和昆虫ISPs约10～100倍)的特点，少量的植物ISPs就有较高的重晶抑制活性。一些能够耐受较低温度的植物，都含有冰结构蛋白，冰结构蛋白也是植物体内普遍存在的一种蛋白质，如苜蓿、冬黑麦、冬小麦、胡萝卜、沙冬青、欧白英(Solanum dulcamara)等。这些植物的某些蛋白具有双重功能，既有抗冻活性，又有酶(β-1、3葡聚糖酶、几丁质酶)、抗菌(如甜味蛋白、LRR蛋白等)、抗虫活性(植物凝集素)，在同源性上反应了他们之间存在的某种联系。
文献中只提及过用辅助碎冰从女贞叶提取冰结构蛋白的方法，但是该方法存在不确定性和缺点，工艺复杂，需要进行冷诱导，提取物杂质多，没有对碎冰进行严格的控制，进而不能严格控制提取率或得率以及质量；女贞叶的冰结构蛋白产物提取是利用冰箱对新鲜女贞叶进行低温诱导，表达、合成和积累，进而提取。该类植物的冰结构蛋白在体内积累和消除有季节性变化，一般在夏季消失，秋季出现，经过冷驯化后冬季达到最高峰。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术中冰结构蛋白提取原料有限、提取工艺复杂、成本较高、提取得到的冰结构蛋白浓度低和不能在冷冻食品与医学上广泛应用的问题，提出了一种冰法提取植物冰结构蛋白的方法。
本发明冰法提取植物冰结构蛋白的方法按以下步骤进行：
一、原料制备
取干植物，除掉植物中的杂质与灰尘并烘干，然后将烘干后的植物粉碎至粒度为60～120目颗粒原料备用；
或取新鲜植物，除掉植物中的杂质与灰尘，粉碎匀浆后，离心过滤得到上清液原料备用；
所述粉碎匀浆的步骤为：将新鲜植物切成0.5cm方块，利用组织匀浆机，在匀浆机中以10000～16000r/min条件下，匀浆时间为10s/次，匀浆间隙30s，连续匀浆3～5次；
所述离心过滤的步骤为：用200目滤布挤出匀浆产物得到滤液，并于4000～6000r/min条件下离心8～15min，得到上清液，覆盖保鲜膜，防止氧化；
所述植物为苜蓿、冬黑麦、冬小麦、胡萝卜、沙冬青或欧白英等。
二、冰球的制备
在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18℃的冰箱中冷冻，得到冰球；
所述玻璃球的直径为1cm；所述得到的冰球的直径为2cm；所述硅胶冰格为耐温为-40℃的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10×2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm；
三、冰结构蛋白提取液的制备
将步骤一制备的颗粒原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1g:(5～30mL)混合得到混合液；
或将步骤一制备的上清液原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1mL:(5～30mL)混合得到混合液；
将得到的混合液置于室温下，进行搅拌提取0.5～3.0h，然后将提取液置于离心机中，在离心机中离心10～15min得到上清液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0～8.5，磷酸根浓度为10～150mmol/L；所述搅拌提取时采用磁力搅拌器，磁力搅拌器的转速为800～1000r/min；所述离心时离心机的转速为8000～10000r/min；
四、冰法提取
向上清液加入冰球，置于-18℃冰箱中，提取2～5min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球，冰球自然融化后，取出其中的玻璃球，得到冰结构蛋白提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；所述加入上清液的冰球量为每100mL上清液10～50个冰球；
五、冰结构蛋白的复提
向剩余的上清液中加入步骤二制备的冰球，重复步骤四2～4次，收集每次提取得到的冰结构蛋白溶液，即完成。
本发明具备以下有益效果：
1、冰结构蛋白的氢原子结合模型认为，冰结构蛋白结构中的氢原子与冰上的氧原子匹配并结合，具有很好的冰结合专一性。即，亲水的一面与冰面结合，而其自身的氨基酸组成和螺旋结构有利于提高该结合的稳定性；本发明利用该冰结构蛋白与冰特异性结合的特点，以及冰结构蛋白与冰不可逆结合的特点通过冰球直接吸附冰结构蛋白，并结合磷酸缓冲溶液法进行提取，减少了冰提蛋白时的用冰量，增大冰吸附冰结构蛋白的面积，进而增加提取液的浓度；
2、本发明可以实现从植物中提取冰结构蛋白，提取率最高可达到5.10％；其中提取率为：最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比；
3、本发明方法中冰球内冻结着一个玻璃球，当冰球融化后，溶液体积减小，而ISPs的吸附量不变，进而可以增加ISPs的浓度，还可以减少冰球的用量，节约成本及操作时间；
4、现有技术中ISPs提取一般采用粗提取、硫酸铵沉淀、离子交换色谱分离过程、凝胶过滤色谱分离过程和高效液相色谱的分离过程等五个步骤，方法繁琐，非抗冻活性组分较多，杂质多质量差，尤其是硫酸铵沉淀，给后续的分离纯化带来很大困难；本发明方法简便，蛋白杂质较少，纯度较高，可直接用于蛋白电泳检测其分子量和抗冻活性的检测，效果好；
5、本发明使用植物干草或新鲜植物提取冰结构蛋白，不需冷诱导，原材料方便易得，成本低；原料来源广，方便易得，成本低，并且提取工艺简单，可以在在冷冻食品和医学上广泛应用；
6、本发明采用磷酸缓冲液结合冰提法，通过严格料液比、磷酸缓冲液的pH、磷酸缓冲液的浓度和冰球添加量，能够准确控制并提高并结构蛋白的提取率，适宜规模化生产。
具体实施方式：
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。
具体实施方式一：本实施方式冰法提取植物冰结构蛋白的方法按以下步骤进行：
一、原料制备
取干植物，除掉植物中的杂质与灰尘并烘干，然后将烘干后的植物粉碎至粒度为60～120目颗粒原料备用；
或取新鲜植物，除掉植物中的杂质与灰尘，粉碎匀浆后，离心过滤得到上清液原料备用；
二、冰球的制备
在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注蒸馏水，然后置于-18℃的冰箱中冷冻，得到冰球；
三、冰结构蛋白提取液的制备
将步骤一制备的颗粒原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1g:(5～30mL)混合得到混合液，或将步骤一制备的上清液原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1mL:(5～30mL)混合得到混合液；
将得到的混合液置于室温下，进行搅拌提取0.5～3.0h，然后将提取液置于离心机中，在离心机中离心10～15min得到上清液；
四、冰法提取
向上清液加入冰球，置于-18℃冰箱中，提取2～5min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球，冰球自然融化后，取出其中的玻璃球，得到冰结构蛋白提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；
五、冰结构蛋白的复提
向剩余的上清液中加入步骤二制备的冰球，重复步骤四2～4次，收集每次提取得到的冰结构蛋白溶液，即完成。
本实施方式具备以下有益效果：
1、冰结构蛋白的氢原子结合模型认为，冰结构蛋白结构中的氢原子与冰上的氧原子匹配并结合，具有很好的冰结合专一性。即，亲水的一面与冰面结合，而其自身的氨基酸组成和螺旋结构有利于提高该结合的稳定性；本实施方式利用该冰结构蛋白与冰特异性结合的特点，以及冰结构蛋白与冰不可逆结合的特点通过冰球直接吸附冰结构蛋白，并结合磷酸缓冲溶液法进行提取，减少了冰提蛋白时的用冰量，增大冰吸附冰结构蛋白的面积，进而增加提取液的浓度；
2、本实施方式可以实现从植物中提取冰结构蛋白，提取率最高可达到5.10％；其中提取率为：最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比；
3、本实施方式方法中冰球内冻结着一个玻璃球，当冰球融化后，溶液体积减小，而ISPs的吸附量不变，进而可以增加ISPs的浓度，还可以减少冰球的用量，节约成本及操作时间；
4、现有技术中ISPs提取一般采用粗提取、硫酸铵沉淀、离子交换色谱分离过程、凝胶过滤色谱分离过程和高效液相色谱的分离过程等五个步骤，方法繁琐，非抗冻活性组分较多，杂质多质量差，尤其是硫酸铵沉淀，给后续的分离纯化带来很大困难；本实施方式方法简便，蛋白杂质较少，纯度较高，可直接用于蛋白电泳检测其分子量和抗冻活性的检测，效果好；
5、本实施方式使用植物干草或新鲜植物提取冰结构蛋白，不需冷诱导，原材料方便易得，成本低；原料来源广，方便易得，成本低，并且提取工艺简单，可以在在冷冻食品和医学上广泛应用；
6、本实施方式采用磷酸缓冲液结合冰提法，通过严格料液比、磷酸缓冲液的pH、磷酸缓冲液的浓度和冰球添加量，能够准确控制并提高并结构蛋白的提取率，适宜规模化生产。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述粉碎匀浆的步骤为：将新鲜植物切成0.5cm方块，利用组织匀浆机，在匀浆机中以10000～16000r/min条件下，匀浆时间为10s/次，匀浆间隙30s，连续匀浆3～5次。其他步骤和参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一所述离心过滤的步骤为：用200目滤布挤出匀浆产物得到滤液，并于4000～6000r/min条件下离心8～15min，得到上清液，覆盖保鲜膜，防止氧化。其他步骤和参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一所述植物为苜蓿、冬黑麦、冬小麦、胡萝卜、沙冬青或欧白英。其他步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二所述玻璃球的直径为1cm；所述得到的冰球的直径为2cm；所述硅胶冰格为耐温为-40℃的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10×2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm。其他步骤和参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0～8.5，磷酸根浓度为10～150mmol/L。其他步骤和参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三所述搅拌提取时采用磁力搅拌器，磁力搅拌器的转速为800～1000r/min。其他步骤和参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述离心时离心机的转速为8000～10000r/min。其他步骤和参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四所述加入上清液的冰球量为每100mL上清液10～50个冰球。其他步骤和参数与具体实施方式一至八之一相同。
为验证本发明的有益效果，进行以下试验：
实施例1
本实施例冰法提取苜蓿干草冰结构蛋白的方法按以下步骤进行：
一、原料制备
取苜蓿干草，除掉植物中的杂质与灰尘并烘干，然后将烘干后的植物粉碎至粒度为80目颗粒原料备用；
二、冰球的制备
在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18℃的冰箱中冷冻，得到冰球；
所述玻璃球的直径为1cm；所述得到的冰球的直径为2cm；所述硅胶冰格为耐温为-40℃的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10×2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm；
三、冰结构蛋白提取液的制备
将步骤一制备的颗粒原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1g:20mL混合得到混合液；
将得到的混合液置于室温下，进行搅拌提取3.0h，然后将提取液置于离心机中，在离心机中离心15min得到上清液；
所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.5，磷酸根浓度为70mmol/L；所述搅拌提取时采用磁力搅拌器，磁力搅拌器的转速为800～1000r/min；所述离心时离心机的转速为10000r/min；
四、冰法提取
向上清液加入冰球，置于-18℃冰箱中，提取2min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球，冰球自然融化后，取出其中的玻璃球，得到冰结构蛋白提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；所述加入上清液的冰球量为每100mL上清液40个冰球；
五、冰结构蛋白的复提
向剩余的上清液中加入步骤二制备的冰球，重复步骤四4次，收集每次提取得到的冰结构蛋白溶液，即完成。
本实施例具备以下有益效果：
1、本实施例冰球中，玻璃球的直径为1cm；冰球的直径为2cm，冰提后冰球融化的冰水体积较不含玻璃球的体积减小了12.51％，进而说明获得的提取液的浓度提高了12.51％；
2、本实施例中，苜蓿冰结构蛋白的提取率为4.26％。其中提取率为：最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比；
3、采用差示扫描量热法分析本实施例制备的苜蓿ISPs的热滞活性(THA)，同时采用差示扫描量热法分析标准牛血清白蛋白(BSA)的热滞活性(THA)作为对比，BSA的热滞活性为0.00～0.01℃，几乎无热滞活性，而本实施例制备的苜蓿ISPs的热滞活性(THA)分别为0.52～0.54℃，说明本实施例制备的苜蓿ISPs的抗冻活性明显强于标准牛血清白蛋白(BSA)，且杂质较少、纯度较高；
4、对本实施例制备的苜蓿ISPs进行氨基酸分析，结果如表1所示，苜蓿ISPs含有17种氨基酸，氨基酸总量为12.52％，由此可知本实施例制备的ISPs纯度较高，可直接用于组成ISPs的氨基酸组成成分检测。
5、对本实施例制备的苜蓿ISPs进行氨基酸分析，结果如表1所示，苜蓿ISPs含有17种氨基酸，氨基酸总量为12.52％，通过计算可得知亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的比例为7:4，说明苜蓿ISPs亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，苜蓿ISPs具有较强的亲水性，与水分子亲和力较强，进而说明本实施例方法的合理性，并且通过检测结果说明本实施例制备的ISPs可直接用于冰结构蛋白的氨基酸组成成分检测。
6、对本实施例制备的苜蓿ISPs进行SDS-PAGE检测，检测结果为，苜蓿ISPs的相对分子量约为52KD，主条带清晰，在30KD到35KD处也有条带，但不明显；由此可以说明，本实施例制备的苜蓿ISPs可直接用于分子量的检测。
表1
实施例2
本实施例一种冰法提取寒地冬小麦面冰结构蛋白的方法按以下步骤进行：
一、冰球的制备
在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18℃的冰箱中冷冻，得到冰球；
所述玻璃球的直径为1cm；所述得到的冰球的直径为2cm；所述硅胶冰格为耐温为-40℃的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10×2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm；
二、冰结构蛋白提取液的制备
按料液比为1g:15mL将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合搅拌得到混合液，将得到的混合液置于室温下，进行搅拌提取3.0h，然后将提取液置于离心机中，在离心机中离心15min得到上清液；
三、冰法提取
向上清液加入冰球，置于-18℃冰箱中，提取5min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球，冰球自然融化后，取出其中的玻璃球，得到冰结构蛋白提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；所述加入上清液的冰球量为每100mL上清液10个冰球；
四、冰结构蛋白的复提
向剩余的上清液中加入步骤二制备的冰球，重复步骤四3次，收集每次提取得到的冰结构蛋白溶液，即完成。
本实施例具备以下有益效果：
1、本实施例制备的冰结构蛋白的提取率为4.56％，其中提取率为：最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比；
2、经差示扫描仪检测本实施例获得的冰结构蛋白的热滞值THA为0.33℃；
3、从电泳结果可以看出，本实施例制备的冰结构蛋白的电泳条带比较清晰，证明提取的冰结构蛋白杂质较少、纯度较高；
实施例3
一种冰法提取胡萝卜冰结构蛋白的方法按以下步骤进行：
一、原料制备
取新鲜胡萝卜，除掉杂质与灰尘，粉碎匀浆后，离心过滤得到上清液原料备用；
所述粉碎匀浆的步骤为：将新鲜植物切成0.5cm方块，利用组织匀浆机，在匀浆机中以10000min条件下，匀浆时间为10s/次，匀浆间隙30s，连续匀浆5次；
所述离心过滤的步骤为：用200目滤布挤出匀浆产物得到滤液，并于4000r/min条件下离心10min，得到上清液，覆盖保鲜膜，防止氧化；
二、冰球的制备
在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18℃的冰箱中冷冻，得到冰球；
所述玻璃球的直径为1cm；所述得到的冰球的直径为2cm；所述硅胶冰格为耐温为-40℃的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10×2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm；
三、冰结构蛋白提取液的制备
将步骤一制备的上清液原料与磷酸盐缓冲溶液按料液比为1mL:20mL混合得到混合液；
将得到的混合液置于室温下，进行搅拌提取1.5h，然后将提取液置于离心机中，在离心机中离心15min得到上清液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8，磷酸根浓度为20mmol/L；所述搅拌提取时采用磁力搅拌器，磁力搅拌器的转速为800r/min；所述离心时离心机的转速为8000r/min；
四、冰法提取
向上清液加入冰球，置于-18℃冰箱中，提取2min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球，冰球自然融化后，取出其中的玻璃球，得到冰结构蛋白提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；所述加入上清液的冰球量为每100mL上清液50个冰球；
五、冰结构蛋白的复提
向剩余的上清液中加入步骤二制备的冰球，重复步骤四4次，收集每次提取得到的冰结构蛋白溶液，即完成。
本实施例具备以下有益效果：
1、本实施例制备的冰结构蛋白的提取率为3.08％；其中提取率为：最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比；
2、经差示扫描仪检测本实施例获得的冰结构蛋白的热滞值THA为0.3℃，胡萝卜冰结构蛋白溶液形成的冰晶颗粒小、数量多；
3、从电泳结果可以看出，本实施例制备的冰结构蛋白的电泳条带比较清晰，证明提取的冰结构蛋白杂质较少、纯度较高。