青蒿转运蛋白AaPDR3及其应用的制作方法

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种青蒿转运蛋白AaPDR3及其应用。
背景技术：
：青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandulartrichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。而研究报道在非分泌腺毛中，有大量萜类物质合成。实验证明石柱烯，β‐法尼烯等萜类物质只在青蒿非分泌型腺毛中合成。ABC(ATPbindingcassette)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。此转运蛋白利用水解ATP释放能量对细胞质内多种生物分子进行跨膜运输，转运底物包括：脂类，氨基酸，生物碱，萜类物质等。根据对于细胞质的转运方向可以粗略分为摄取转运蛋白(importer)和外排转运蛋白(exporter)。ABC转运蛋白的特征是具有ATP结合区域(ATP‐bindingcassette)，也被称为核酸结合区域NBD(nucleotide‐bindingdomain)，具有一些非常保守的motif，包括WalkerA和WalkerB序列、ABCsignaturemotif、Hloop和Qloop。植物中有大量的ABC转运蛋白，近年来的研究表明植物ABC转运蛋白不仅仅涉及到植物激素、酯类、金属离子、次生代谢物、外源化学物质的转运有关，而且对于植物和病原体互作以及离子通道的建成都有重要作用。PDR(pleiotropicdrμgresistance)转运蛋白属于ABC转运蛋白家族G亚家族，包含反向的NBD‐TMD类型的转运蛋白。如果通过对青蒿分泌型腺毛转录组数据库分析，筛选出参与青蒿素合成途径相关转运蛋白，并且验证其功能，那么就可以利用基因工程手段提高转运蛋白的转运效率，从而提高青蒿中青蒿素的含量。AaPDR3是从青蒿中克隆得到的一个ABC转运蛋白中PDR(Pleiotropicdrμgresistance)亚家族的转运蛋白。采用基因工程手段，将该AaPDR3转运蛋白RNAi干扰载体和过量表达载体转化青蒿，RNAi干扰转基因植株中倍半萜石柱烯合成显著被抑制，而过量表达转基因植株在倍半萜石柱烯有部分提高。此外，AaPDR3转运蛋白RNAi干扰载体转化青蒿，RNAi干扰转基因植株中青蒿素含量有显著提高。因此，AaPDR3基因的研究对于提高青蒿中倍半萜石柱烯基因工程育种具有重要意义。技术实现要素：本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种青蒿转运蛋白AaPDR3及其应用，该转运蛋白AaPDR3在青蒿老叶、根及花蕾中表达量较高，并随着叶片衰老，表达量不断提高。其启动子融合GUS转青蒿证明AaPDR3为青蒿非分泌型腺毛特异表达和根中表达的转运蛋白；烟草和酵母亚细胞定位证明AaPDR3定位于细胞膜上(图1)。利用转基因技术将青蒿AaPDR3转运蛋白干扰载体和过量表达载体转化青蒿，RNAi干扰转基因植株中倍半萜石柱烯的合成显著被抑制，而过量表达转基因植株倍半萜石柱烯有部分提高。此外，AaPDR3转运蛋白RNAi干扰载体转化青蒿，RNAi干扰转基因植株中青蒿素含量有显著提高。AaPDR3基因的研究对于提高青蒿中倍半萜石柱烯基因工程育种具有重要意义。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种青蒿转运蛋白AaPDR3，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述的青蒿转运蛋白AaPDR3在青蒿非分泌型腺毛中影响倍半萜石柱烯的合成和转运。所述的转运蛋白由如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列编码。本发明进一步涉及一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。本发明涉及一种具有青蒿转运蛋白AaPDR3的转基因青蒿苗实现方法，包括如下步骤：步骤一，将青蒿转运蛋白AaPDR3的蛋白编码序列分别连于植物RNAi干扰和过量表达载体上，构建得到含青蒿AaPDR3转运蛋白编码序列的植物RNAi干扰和过量表达载体；步骤二，将植物RNAi干扰表达载体和过量表达载体转入农杆菌，再将农杆菌转入青蒿；所述转入具体为：采用冻融法进行转入。所述的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EH105，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar1)。步骤三，通过抗生素筛选得到青蒿抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗。所述的PCR检测是指，分别设计合成AaPDR3基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。本发明涉及一种基于上述转基因青蒿苗的应用，将其用于提高青蒿萜类物质含量。所述的青蒿萜类物质，通过对所述转基因青蒿苗进行GC‐MS测定分析，进而获得倍半萜石柱烯、β‐法尼烯和吉马烯D；通过HPLC测定分析青蒿素含量。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的青蒿AaPDR3蛋白多肽时，可以将青蒿AaPDR3蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaPDR3蛋白表达载体。“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。技术效果与现有技术相比，本发明通过对青蒿非分泌型腺毛转录组数据分析，从青蒿中克隆AaPDR3基因，构建含AaPDR3基因的植物过量表达和干扰表达载体，用根癌农杆菌EH105介导，采用叶盘法将AaPDR3基因过量表达和干扰表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaPDR3的整合情况，通过气相色谱和质谱联用(GC‐MS)测定青蒿中倍半萜含量，表明获得RNAi干扰转基因植株中倍半萜石柱烯的合成显著被抑制，而过量表达转基因植株倍半萜石柱烯提高。此外，AaPDR3转运蛋白RNAi干扰载体转化青蒿，RNAi干扰转基因植株中青蒿素含量有显著提高。附图说明图1为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；图中：M：分子量标记；泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道3‐13分别是11株转基因青蒿植株基因组为模版，进行PCR得到的产物；图2为AaPDR3基因过量表达和干扰载体转化青蒿，通过液相色谱(HPLC)测定青蒿中青蒿素含量；图中：A为AaPDR3干扰转基因青蒿中AaPDR3基因表达量，B为AaPDR3干扰载体转化青蒿，通过气相色谱和质谱联用(GC‐MS)测定青蒿中倍半萜含量，C为AaPDR3过量表达转基因青蒿中AaPDR3基因表达量，D为AaPDR3过量表达载体转化青蒿，通过气相色谱和质谱联用(GC‐MS)测定青蒿中倍半萜含量，E为AaPDR3基因过量表达和干扰载体转化青蒿中青蒿素含量。具体实施方式实施例1青蒿AaPDR3基因的克隆1.青蒿基因组总RNA的提取取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2.青蒿AaPDR3基因的克隆以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据AaPDR3基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增AaPDR3基因，并测序。通过上述步骤，获得了青蒿中该转录蛋白的全长4278bp，编码序列，即核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，并推导出其蛋白编码序列如SEQIDNo.2所示，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。表1为上述基因特异性正反引物，即AaPDR3‐FP1(SEQIDNo.3)和AaPDR3‐RP1(SEQIDNo.4)引物名称引物序列(5’→3’)AaPDR3‐FP1TTCTCGTAGGGCTTTTTGAGCATTAAaPDR3‐RP1GCCATACAAAGACGCTAATAGAACTCA表2为上述PCR的反应体系青蒿cDNA1μL10×KODPlusBuffer5μLdNTP5μLMgSO42μLAaPDR3‐FP11μLAaPDR3‐RP11μLKODPlus1μLddH2O34μL总体积50μL实施例2含AaPDR3基因的植物干扰表达载体的构建1.中间载体pTOPO‐AaPDR3的构建在AaPDR3基因的非保守区域设计上游引物和下游引物，用以构建干扰载体。在上游引物前添加CACC四个碱基以构建Gateway入门载体。按照Invitrogen公司pENTRTM/CloningKit的操作步骤，先用平端酶扩增得到AaPDR3的片段，回收纯化后通过Gateway克隆技术连接到pENTR/D‐TOPO载体。2.植物表达干扰载体pHELLSGATE1.2‐AaPDR3的构建按照Invitrogen公司的LRIIEnzyme试剂盒的操作，将pTOPO‐AaPDR3载体中的AaPDR3的干扰片段重组到RNA干扰载体pHELLSGATE1.2的两个可以形成发夹结构的重组位点中，得到AaPDR3的RNA干扰载体pHELLSGATE1.2‐AaPDR3。本实施例将青蒿AaPDR3基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含AaPDR3发卡结构的植物表达干扰载体，该载体可用于通过代谢工程策略来调控青蒿中青蒿素的含量。所需引物如表3所示：表3为上述干扰载体pHELLSGATE1.2‐AaPDR3体构建所采用的PCR引物AaPDR3‐RNAi‐FP(SEQIDNo.5)和AaPDR3‐RNAi‐RP(SEQIDNo.6)引物名称引物序列(5’→3’)AaPDR3‐RNAi‐FPCACCATGGATGGAAGTGATATTTATAAAaPDR3‐RNAi‐RPCATCAACTTCTTCTGAAGGTCCAG实施例3含AaPDR3基因的植物过量表达载体的构建将AaPDR3基因构建在过量表达载体上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了BamHI的酶切位点，反向引物中引入了XbaI的酶切位点，引物如表4所示；表4为上述过量表达载体构建所采用的PCR引物BamHI‐AaPDR3‐FP(SEQIDNo.7)和AaPDR3‐XbaI‐RP(SEQIDNo.8)引物名称引物序列(5’→3’)BamHI‐AaPDR3‐FPCGGGATCCATGGATGGAAGTGATATTTAAaPDR3‐XbaI‐RPGCTCTAGACTATCTCTTTTGGAAATTAAATGC实施例4根癌农杆菌介导的AaPDR3过量表达和干扰载体遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株1.含AaPDR3过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得将实施例2中含AaPDR3的植物双元干扰表达载体采用冻融法转入市售的根癌农杆菌(如EHA105，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaPDR3的植物双元干扰表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。2.根癌农杆菌介导AaPDR3基因转化青蒿2.1.外植体的预培养青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3‐4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(MurashigeandSkoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。2.2.农杆菌与外植体的共培养将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaPDR3植物过量表达和干扰表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。2.3.抗性再生植株的筛选将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6‐BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Hyg100mg/L+Cb500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2‐3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb125mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生青蒿植株。3.转基因青蒿植株的PCR检测根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaPDR3分别设计正向引物设计pHellsgate‐35S‐FP(SEQIDNo.9)和反向引物AaPDR3‐RNAi‐RP(SEQIDNo.6)对干扰转基因植株进行检测；正向引物设计引物35SF(SEQIDNo.10)和反向引物AaPDR3‐RP(SEQIDNo.11)对过量表达转基因植株进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaPDR3植物干扰表达载体和过量表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。实施例5利用GC‐MS测定转基因青蒿中倍半萜石柱烯、β‐法尼烯和吉马烯D含量1.GC‐MS条件及系统适用性以及标准溶液的配制GC‐MS分析仪器为：Agilent(7890AGC/5975CMS，USA)，分析柱子为AgilentDB‐5MScolumn(30m×0.25mm×0.25μm)。先将炉温预热至270℃，取1μl样品进样，进样模式为无分流模式；升温程序为：60℃3min，从60℃到300℃加温过程为10℃/min，加温程序结束后保持9min；整个测定过程的总时间为50min；电子碰撞电离质谱的电离能记录从70eV到1765V，质谱扫描范围为m/z33to500。根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的倍半萜石柱烯、β‐法尼烯和吉马烯D含量，再除以青蒿冻干粉干重，从而计算出石柱烯，β‐法尼烯和吉马烯D占样品鲜重的含量。精确地用二氯甲烷稀释石柱烯，β‐法尼烯和吉马烯D标准品(Sigma公司)，得到石柱烯，β‐法尼烯和吉马烯D标准品溶液，保存于‐20℃备用。2.GC‐MS样品数据分析数据分析软件为：MSDChemStationsoftware(versionE.02.02.1431)，将样品中分离产物的保留时间及质谱图同数据库(NIST11)标准化合物进行比对共同鉴定分离产物的成分。3.样品的制备在青蒿植株的上，中和下部共取新鲜的青蒿叶片。青蒿叶片及幼嫩小枝液氮中粉碎后，‐50℃冷冻干燥8h。精确称取50mg样品粉末置10mlL玻璃试管中，加4mL正己烷和100μL反式法尼醇标准液(77.6μg/mL)超声提取40min，冷却至室温后离心取上清液，上清液氮气吹干后用200μL二氯甲烷溶解，上样分析。对于倍半萜石柱烯、β‐法尼烯和吉马烯D含量测定，结果如图2所示，结果表明，RNAi干扰转基因植株中倍半萜石柱烯合成显著被抑制，而过量表达转基因植株倍半萜石柱烯有部分提高。实施例6利用HPLC测定转基因青蒿中青蒿素含量HPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制HPLC：采用wateralliance2695系统，使用WatersC18柱，青蒿素测定流动相使用甲醇:水体积比60％：40％，二氢青蒿酸测定流动相适用乙腈：0.1％冰醋酸(pH3.2)体积比60％：40％；流速为1.0mL/min；ELSD检测系统为wateralliance2420，蒸发光散射检测器漂移管温度为40℃，载气压力5bar；青蒿素出峰时间为7min左右。青蒿素进样体积为20uL。根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的青蒿素含量，再除以青蒿粉末干重，从而计算出青蒿素占样品干重的含量。精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于‐20℃备用。样品的制备在青蒿植株的上，中和下部共取新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶片，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mLEppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC测定。对于青蒿素含量测定，结果如图2所示，结果表明，RNAi干扰转基因植株中青蒿素含量有显著提高。上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。序列表<110>上海交通大学<120>青蒿转运蛋白AaPDR3及其应用<130>11<170>PatentInversion3.5<210>1<211>4278<212>DNA<213>青蒿(ArtemisiaannuaL.)<400>1atggatggaagtgatatttataaagctagtagtagcttaaggttagggagtaatagtgga60agaatgggaagtattagagctggaagctctacccgatggaggaacactggcatggatgtt120ttctcgagatcaactcgtgaagaagatgacgaggaagctttgaaatgggctgctttagaa180aagcttccgacttacgaccgtttaaagaaaggtttgatctttgggtcaactggaccttca240gaagaagttgatgtagctagtcttggttttgaagaacgaaaacgattacttgagaggctt300gttcgtagtgctgatgaagataatgagaagttcttgctaaagttcaggaacagaattgat360agggttgggcttgatttgccaaaaattgaagtcaagtttgagcatttgactgttgaggcc420gatattaatacaggaagcagagctttacctagttttataaacttccatattgatatattt480gagatgttcttgagcttattccgtctacttccaaatacgaaaaaacatataacaatcctt540gacgatgttagcgggcttgttaagcctagcagaatgacgttacttttgggacctccaagt600tctgggaagacgacattgttgttagccttggctggaaagctcgataaggagcttaagagc660tcagggaaggtgacatacaatgggcatgagttacatgaatttgtacctcaaagaacctct720gcttatatcagtcaagatgatgtgcatatcggagaaatgactgtcagagaaaccttggct780ttctctgcacgatgccaaggggtcggatcgcgttatgagatgttggccgagctgtcaaga840agagaaaaagatgcaaacattaaacctgatcctgatgttgatgtcttcatgaagtctgcg900gcatcagaaggtcaagaagcgaatgtggtgacagattacactcttaagatgttggggttg960gacgtttgtgcagataccatggtaggggatcaaatgattagggggatatccggtgggcaa1020aagaagcgtgttacaacaggtgaaatgatagttggaccatcgaatgttcttctcatggat1080gagatttcaactggtttggatagttctacaacttttcaaattgtgaaatcgtttagacaa1140tatcttcatatccttgaagcaactgctgttatttctcttctccaaccagcacccgagaca1200tataatttatttgatgacattatacttttaactgaggggaaaatagtgtaccaaggacca1260cgtgacaatgtgctagagttttttgaatttatggggttcaaatgccccgagaggaaaggc1320gttgcggattttttgcaagaagtgacttcgagaaaagatcaacagcaatactggatgaga1380agaaatgaggattacagattcgtatcagccaaggaattcgctgattctttccaatcattc1440catattggaaagagactgaaggaggatctagccaccccgtatgacaaatccagaagccac1500ccggctgctctcactacagagaagtacggtttaaataagaaagagctcttgaaagcttgc1560atcgagagagagatcttgcttatgaagagaaactcatttgtttactacttcaaattgtcc1620caactacttttgatgtcgctagttgctatgactgtatttttccgaaccgagatgagcaaa1680gataacgtggaagatggagggatatatatgggtgctctattctttggtgttattatgatc1740atgtttaatgggatggctgagatttcaatgacaattgccaagcttcctgtgttctacaaa1800caacgagacttcctgttttacccctcgtgggcatacgctcttccatcatggatagtcaag1860atccccgtttcgtttattgaagttgccctgtggacgattctcacttactatgtgattgga1920tttgatcccaatatcacaagattcttccggcagtactttttactcttaattgtaaaccag1980atgtctgctgcattgtttagattcattggagcaatgggacggaacatgattgttgcaaat2040acattcggttcatttgcccttctcataatgtttgcattgggtggctttgtcctagcacga2100gatgatgtaaagaagtggtggttatggggttactggacgtcgccaatgatgtatgcgatg2160aatgggattgtagttaatgaatttctctcaaacagctggaataagcctataaatgatact2220acactagggaaaagtatcatcacctctcgaggcttcttcacggatgcttactggtattgg2280cttggtgttgtggcctcagttggatttatttttttcttcaacttgtgtttcggtttgtct2340cttgcgtttctcaacccatttgggaagtcccgatctactgtatcacagaatgatagtgac2400aaagattcagttgagttatcatctagtgacgagagaaataaaaacaagaagaaaggaatg2460gttcttccttttgagccacattcaattaccttcaacgatgtcaaatactcggtcgatatg2520ccacaggaaatgagagagcaaggaacgaacgaagctagattgacgctacttaagagtgtg2580agcggagctt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