一种山香圆叶中多糖的提取方法及其应用与流程

本发明涉及天然产物的提取领域，尤其涉及一种山香圆叶中多糖的提取方法。

背景技术：

山香圆叶为省沽油科植物山香圆(Turpinia arguta Seem.)的干燥叶。夏、秋二季叶茂盛时采收，除去杂质，晒干。味苦，寒。归肺、肝经。清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。在我国，主产于江西、福建、广东、广西等省。民间用鲜叶水煎内服治疗扁桃体炎、咽喉炎，预防感冒，或鲜叶捣烂外敷治疗疮疥，均有显著疗效。现代药理研究表明，山香圆具有抗菌、抗炎、镇痛以及调节免疫作用；而对山香圆叶的研究仅仅是其总黄酮成分的抗炎作用。

山香圆叶单味药材制剂市场上有山香圆片剂和口服液，具有清热解毒、利咽消肿的功效，临床主要用于治疗咽部炎症，如扁桃体炎、咽炎、喉炎等，临床应用多年，疗效确切。作为中国药典2010年版新收载的药材，目前对其研究不多，发挥主要活性药效作用的物质基础尚未明确。张磊等研究了山香圆总黄酮的抗炎作用，山香圆提取物对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀、角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀、棉球诱导的大鼠肉芽肿和福氏完全佐剂诱导的大鼠佐剂关节炎具有抗炎作用，且疗效优于阳性对照药山香圆总提取物(张磊，李俊，余世春，等.山香圆总黄酮体外对大鼠佐剂性关节炎免疫功能的影响[J].中国药理学通报,2007,23(1):106-110.)。马双刚等采用脂多糖LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞炎症模型对山香圆叶中分离得到的化合物进行抗炎活性评价，结果表明2个黄酮苷类化合物有较弱的抗炎活性(马双刚,袁绍鹏,侯琦,李勇,陈霞,庾石山.山香圆叶中黄酮苷类成分及其抗炎活性研究[J].中国中药杂志,2013,11:1747-1750.)。山香圆叶的主要成分有三萜、黄酮、酚酸、苷类等，但目前主要只研究了山香圆叶中黄酮成分，其水溶性大分子的多糖成分提取方法以及生物活性未见报道。

作为中草药有效成分之一的多糖存在于所有的生物中，是自然界中含量最丰富的生物聚合物，多糖因其具有多种生物活性而越来越受到人们的关注。其中最为重要的是从植物中尤其是从中草药中提取的水溶性多糖，在诸多生命活动中发挥着免疫调节、延缓衰老、抗炎、降血糖、降血脂等保护心血管等重要的作用。机体在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，易损伤组织，引起各种疾病，包括肿瘤、衰老、心血管系统损伤。天然抗氧化剂成分的毒性远远低于人工合成的抗氧化剂，因此，近年来从自然界寻求天然抗氧化剂的研究日益受到关注；大量的研究表明，大部分从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化等抗氧化作用。目前使用的炎症治疗物多为合成药物、抗组胺剂、类固醇、可的松、免疫抑制剂和免疫激动剂，但这些药物仅暂时性地缓解炎症且具有诸如超敏反应和免疫系统退化等副作用。现在传统的合成类抗炎药物已很难满足社会需求，天然药物成为医药界关注的热点，天然多糖的抗炎作用也逐渐得到人们的肯定并不断深入探索。

技术实现要素：

本发明的目的首先是提供一种山香圆叶中多糖的提取方法，包括如下步骤：

1)用乙醇溶液对山香圆叶的粉末进行回流提取，收集残渣；

2)在超声波的作用下，对所述残渣的水溶液进行酶解，离心后取上清液；

3)将所述上清液浓缩至生药量0.5～1g/ml，调节其中无水乙醇的浓度为75～85％，低温静置后离心，收集沉淀；

4)用sevage溶液法对所述沉淀进行脱蛋白处理，得脱蛋白的多糖溶液；

5)再次调节所述脱蛋白的多糖溶液中无水乙醇的浓度为75～85％，低温静置后离心，收集二次沉淀，干燥后得山香圆叶多糖。

本发明所述的山香圆叶粉末为山香原叶干燥果穗药材制备成的粉末，其粒度为60～80目。

本发明所使用的纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。

优选的，所述超声波的功率为200～300w。

优选的，酶解过程中，所述水和滤渣的液料比为30～40ml/g，纤维素酶的添加量为所述水的质量的3.5～4％，酶解时间为30～40min，温度为25～35℃。

优选的，所述步骤2)中的离心条件为转速2000～3000r/min，时间10～15min。

优选的，所述回流提取的具体操作为，乙醇溶液和山香圆叶粉末按10～20mL/g液料比混合，在50～70℃下回流提取4～5h后，过滤得残渣，将所残渣在室温下自然干燥后收集。

优选的，sevage溶液中正丁醇和氯仿的体积比为4:1。

优选的，所述脱蛋白处理的具体操作为将所述沉淀经少量水溶解后，加入为其体积1/4的sevage溶液，搅拌后于2～6℃静置1～2h，以4000～5000转/min进行离心，10～15min后收集上清液；重复以上操作进行5～7次，将每次所得上清液混合，得脱蛋白多糖溶液。

优选的，所述步骤3)或步骤5)的具体操作为，调节乙醇浓度为80％，于2～6℃下静置12～24h，再分别以4000～5000转/min进行离心，10～15min后收集沉淀。

本发明的另一目的是保护由本发明所述的方法提取得到的山香圆叶多糖。

本发明的最后一个目的是保护本发明所述提取得到的山香圆叶多糖在制备抗氧化组合物、抗炎类药物、保护心血管药物和降血脂药物方面的应用。

本发明所述的方法具有如下有益效果：

1、本发明提供了山香圆叶多糖的最优提取工艺；本发明不仅利用酶解技术破坏植物细胞壁促进细胞内活性多糖成分的充分溶出、提高多糖含量、避免其他有害溶剂提取造成的安全隐患，而且利用低功率超声波振动，低温提取，在降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省提取时间、降低能量成本；

2、本发明对纤维素酶浓度、提取温度、提取时间、液料比等因素进行了优化，实现了多糖提取率的最大化；且本发明工艺简单，绿色、无毒且环保，适于工业化推广。

3、本发明所述的山香圆叶多糖可作为活性成分，具有良好的清除自由基抗氧化作用，可发展作为天然抗氧化保健品用途。

4、本发明所述的山香圆叶多糖处理脂多糖LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，能抑制细胞致炎因子IL-1β、TNF-α和炎症介质NO，并且呈一定的剂量依赖性，具有良好的抗炎活性，可发展作为抗炎药物及保健品用途。

5、本发明所述的山香圆叶多糖，能够很好的抑制血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖，具有心血管保护作用，开阔了山香圆叶多糖的药用价值。

6、本发明所述的山香圆叶多糖，对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用，具有良好的抗炎活性。

7、本发明所述的山香圆叶多糖，能显著降低高血脂模型大鼠的高血脂，具有降血脂作用，可开发降脂保健用途。

附图说明

图1为山香圆叶多糖(TFP)和Trolox的ABTS⁺自由基清除率；

图2为山香圆叶多糖(TFP)的Fe³⁺抗氧化能力；

图3为山香圆叶多糖(TFP)的DPPH自由基清除率；

图4为山香圆叶多糖对细胞活力的影响；

图5为山香圆叶多糖对IL-1β含量的影响；

图6为山香圆叶多糖对TNF-α含量的影响；

图7为山香圆叶多糖对NO含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例涉及一种山香圆叶中多糖的提取方法，包括如下步骤：

(1)药材前处理：将唇形科植物山香圆叶(Turpiniae Folium)的干燥果穗药材粉碎至60目，以20mL/g液料比加入体积浓度为95％的乙醇溶液，在60℃下回流提取5h后，残渣过滤，收集滤渣置于空气中自然干燥，备用，即得脱除脂类、色素和小分子糖的山香圆叶粉末。

(2)提取：取(1)步骤得到的山香圆叶粉末100g，在超声波反应器中，按35mL/g料液比加入3.5％纤维素酶溶液，在200W的超声波功率下和25℃温度下进行40min提取，提取后以2500转/min进行离心，10min后收集上清液A；

(3)浓缩：上清液A经60℃真空旋转蒸发浓缩至浓度约为含生药1g/mL，得到浓缩产物；

(4)醇沉：在浓缩产物中加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于6℃下静置18h，再以5000转/min进行离心，10min后收集沉淀；

(5)脱蛋白：上述沉淀经少量水溶解后，加入1/4倍体积的sevage溶液(正丁醇-氯仿4:1)搅拌，4℃静置1h，以5000转/min进行离心，10min后收集上清液，再重复以上操作进行5次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；

(6)第二次醇沉：脱蛋白多糖溶液浓缩至无醇味，加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于6℃下静置18h，再分别以5000转/min进行离心，10min后收集沉淀，得脱蛋白多糖；

(7)干燥：脱蛋白多糖加少量水复溶，于-80℃预冻4h，最后在大气压力为100Pa、温度为-55℃的条件下冷冻干燥72h，得到山香圆叶多糖提取物干燥粉末4.65g。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量为37.73％，并计算多糖得率：

多糖产率(％)＝[(多糖含量×多糖提取物重量)/药材重量]×100％＝37.73％×4.65/100*100％＝1.75％

实施例2

本实施例涉及一种山香圆叶中多糖的提取方法，包括如下步骤：

(1)药材前处理：将唇形科植物山香圆叶(Turpiniae Folium)的干燥果穗药材粉碎至80目，以10mL/g液料比加入体积浓度为90％的乙醇溶液在75℃下回流提取4.5h后，残渣过滤，收集滤渣置于空气中自然干燥，备用，即得脱除脂类、色素和小分子糖的山香圆叶粉末。

(2)提取：取(1)步骤得到的山香圆叶粉末100g，在超声波反应器中，按40mL/g料液比加入4.0％纤维素酶溶液，在300W的超声波功率下和30℃温度下进行30min提取，提取后以2500转/min进行离心，15min后收集上清液A；

(3)浓缩：上清液A经50℃真空旋转蒸发浓缩至浓度约为含生药0.5g/mL，得到浓缩产物；

(4)醇沉：在浓缩产物中加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于5℃下静置24h，再以4000转/min进行离心，10min后收集沉淀；

(5)脱蛋白：上述沉淀经少量水溶解后，加入1/4倍体积的sevage溶液(正丁醇-氯仿4:1)搅拌，4℃静置1h，以4000转/min进行离心，15min后收集上清液，再重复以上操作进行6次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；

(6)第二次醇沉：脱蛋白多糖溶液浓缩至无醇味，加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于5℃下静置24h，再分别以4000转/min进行离心，15min后收集沉淀，得脱蛋白多糖；

(7)干燥：脱蛋白多糖加少量水复溶，于-75℃预冻4h，最后在大气压力为100Pa、温度为-70℃的条件下冷冻干燥72h，得到山香圆叶多糖提取物干燥粉末4.82g。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量为38.10％，并计算多糖得率：

多糖产率(％)＝[(多糖含量×多糖提取物重量)/药材重量]×100％＝38.10％×4.82/100*100％＝1.83％

实施例3

本实施例涉及一种山香圆叶中多糖的提取方法，包括如下步骤：

(1)药材前处理：将唇形科植物山香圆叶(Turpiniae Folium)的干燥果穗药材粉碎至60目，以15mL/g料液比加入体积浓度为90％的乙醇溶液在55℃下回流提取5h后，残渣过滤，收集滤渣置于空气中自然干燥，备用，即得脱除脂类、色素和小分子糖的山香圆叶粉末。

(2)提取：取(1)步骤得到的山香圆叶粉末100g，在超声波反应器中，按30mL/g料液比加入3.7％纤维素酶溶液，在250W的超声波功率下和35℃温度下进行35min提取，提取后以3000转/min进行离心，15min后收集上清液A；

(3)浓缩：上清液A经55℃真空旋转蒸发浓缩至浓度约为含生药1g/mL，得到浓缩产物；

(4)醇沉：在浓缩产物中加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于4℃下静置12h，再以5000转/min进行离心，10min后收集沉淀；

(5)脱蛋白：上述沉淀经少量水溶解后，加入1/4倍体积的sevage溶液(正丁醇-氯仿4:1)搅拌，4℃静置1h，以5000转/min进行离心，10min后收集上清液，再重复以上操作进行7次脱蛋白，得脱蛋白多糖溶液；

(6)第二次醇沉：脱蛋白多糖溶液浓缩至无醇味，加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于4℃下静置12h，再分别以5000转/min进行离心，10min后收集沉淀，得脱蛋白多糖；

(7)干燥：脱蛋白多糖加少量水复溶，于-70℃预冻4h，最后在大气压力为100Pa、温度为-60℃的条件下冷冻干燥72h，得到山香圆叶多糖提取物干燥粉末4.76g。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量为38.71％，并计算多糖得率：

多糖产率(％)＝[(多糖含量×多糖提取物重量)/药材重量]×100％＝38.71％×4.76/100*100％＝1.84％

对比例1

同实施例1相比，其区别在于，所述步骤2)中，控制超声波的功率为100W，酶的添加量为1.0％，酶解的时间为20min，多糖的产率为0.95％。

对比例2

与实施例1相比，其区别在于，所述脱蛋白过程中的操作条件为加入1/4倍体积的sevage溶液(正丁醇-氯仿4:1)搅拌，4℃静置0.5h，以3000转/min进行离心，5min后收集上清液，再重复以上操作进行2次脱蛋白，多糖的产率为1.02％。

对比例3

与实施例1相比，其区别在于，所述醇沉过程中的操作条件为在浓缩产物中加入其体积4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80％时，于4℃下静置5h，再以3000转/min进行离心，5min后收集沉淀；多糖的产率为1.29％。

实验例1

本实验例涉及本发明所提取得到的山香圆叶多糖的抗氧化性研究。

1)ABTS法：配制ABTS和过硫酸钾的混合溶液，使ABTS和过硫酸钾的浓度分别为7mmol/L和2.45mol/L，室温下，避光静置过夜，即得到ABTS+溶液。使用时要稀释ABTS+溶液，使得其在414nm处的吸光度为0.700±0.02。依次取20μL(0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、6.0mg/mL)浓度的多糖溶液于200μL的ABTS+溶液，充分混匀，在37℃水浴中保温20min，测定其在414nm处吸光度As；以水代替样品溶液作为空白对照，吸光度为Ab；以Trolox作参比，每份平行3次，计算多糖对ABTS+自由基的清除率，结果如图1。

在质量浓度0.5-6mg/mL范围内，山香圆叶多糖(TFP)对ABTS⁺自由基最大清除率为60.87％，标准Trolox的ABTS⁺自由基清除率几乎都在92％，说明山香圆叶多糖具有良好的抗氧化性。

2)FRAP法：取标准FeSO₄溶液、TPTZ溶液和醋酸钠缓冲液配制标准系列溶液，在37℃反应30min，然后测定溶液在593nm处吸光度，绘制FRAP标准曲线。

配制TPTZ工作液，用乙醇为溶剂，分别取5μL(0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、6.0mg/mL)各浓度的山香圆叶多糖待测溶液和Trolox加入180μL工作液中，在37℃反应30min，然后测定溶液在593nm处吸光度。每份平行3次，依据FRAP标准曲线计算各溶液的抗氧化活性(FRAP值)。结果如图2。

山香圆叶多糖具有一定的还原力，在质量浓度0.5-6mg/mL范围内，山香圆叶多糖随着质量浓度增加而还原力增加，且具有明显的量效关系。还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱。在质量浓度6mg/mL时，多糖的FRAP值为2.07mmoL/g。

(3)DPPH法：将DPPH溶于无水乙醇中，配制浓度为0.1mmol/L的溶液。将山香圆叶多糖样品稀释至(0.5、1.0、2.0、3.5、5.0、6.0mg/mL)浓度。分别取20μL多糖溶液于200μL DPPH中，室温下静置30min后于515nm处测定吸光度A_s，以无水乙醇作为试剂空白，吸光度记作为A_b，以DPPH溶液作为对照，吸光度记A_c；以Trolox作参比，每份平行3次，计算多糖对DPPH自由基的清除率，结果如图3。

在质量浓度0.5-6mg/mL范围内，山香圆叶多糖(TFP)对DPPH自由基最大清除率为71.71％，表明山香圆叶多糖具有良好的抗氧化活性。

实验例2

本实验例涉及本发明获得的山香圆叶多糖对脂多糖LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的抗炎作用研究。

(1)MTT比色法测定细胞活力：取对数生长期RAW 264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO ₂条件下培养过夜后，加入不同浓度(0、10、25、50、100μg/mL)山香圆叶多糖溶液，考察药物加入后对细胞的影响，上述各药物组细胞培养过夜后，在各孔细胞中加入5mg/mL MTT 20μL，温度37℃，5％CO2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值，结果如图4。

(2)ELISA法测定白介素1β(IL-1β)：将对数生长期RAW 264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10⁵个/ml，每孔1mL，温度37℃，5％CO ₂条件下培养，山香圆叶多糖组(终浓度为0、10、25、50、100μg/mL)，在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖LPS(终浓度为1μg/mL)，先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖LPS，刺激细胞共孵育16h，每组处理重复3孔。ELISA法测定山香圆叶多糖处理后的RAW 264.7巨噬细胞分泌的白介素1β(IL-1β)因子的含量(图5)。注：与LPS组比较**P<0.05，*P<0.01

(3)ELISA法测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5％CO₂条件下培养，山香圆叶多糖组(终浓度为0、10、25、50、100μg/mL)，在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖(终浓度为1μg/mL)，先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖，刺激细胞共孵育16h，每组处理重复3孔。ELISA法测定山香圆叶多糖处理后的RAW 264.7巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量，如果如图6。(注：与LPS组比较**P<0.05，*P<0.01)

(4)ELISA法测定一氧化氮(NO)含量：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5％CO2条件下培养，山香圆叶多糖组(终浓度为0、10、25、50、100μg/mL)，在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖(终浓度为1μg/mL)，先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖，刺激细胞共孵育16h，每组处理重复3孔。ELISA法测定山香圆叶多糖处理后的RAW 264.7巨噬细胞分泌的一氧化氮(NO)含量(图7)。注：与LPS组比较**P<0.05，*P<0.01

根据本发明所述的MTT比色法测定细胞活力结果，不同浓度山香圆叶多糖(TFP)对巨噬细胞RAW264.7的增殖无显著差异，表明TFP对其增殖无影响，安全无毒；本发明所述的TFP可有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞过表达的两种炎症细胞因子：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)。本发明所述的TFP可有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生过量的炎症介质NO，且其作用呈现浓度依赖性。表明TFP具有良好的抗炎效果。

实验例3

本实验例涉及获得的山香圆叶多糖对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖的抑制作用研究

(1)血管平滑肌细胞的培养及分组：

在无菌条件下，组织贴块法培养血管平滑肌细胞(VSMC)，用含20％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下进行培养。倒置相差显微镜下观察，细胞为梭形或长梭形，排列成放射状、旋涡状，呈典型“谷”与“峰”生长现象，进行传代培养，取第4～8代细胞进行实验。胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5.0×107个/L，接种于培养板备用。经24h预培养和12h低浓度(1％)血清培养基预处理后，随机分组：

①正常组：不加特殊处理因素；②模型组(Ang Ⅱ组)：Ang Ⅱ10-7mol/L；③山香圆叶多糖低剂量组：Ang Ⅱ10-7mol/L+1mg/L山香圆叶多糖；④Ang Ⅱ10-7mol/L+10mg/L山香圆叶多糖中剂量组；⑤山香圆叶多糖高剂量组Ang Ⅱ10-7mol/L+100mg/L山香圆叶多糖。继续培养24h，胰蛋白酶消化培养细胞。

(2)MTT法检测山香圆叶多糖对Ang Ⅱ诱导VSMC增殖的影响

将5.0×107个/L细胞悬液接种于96孔培养板，每孔200μL细胞悬液。同上培养和分组后，每组设6个复孔，继续培养48h。换无血清培养基，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，弃培养液，加入DMSO 0.15mL，震荡、混匀后于酶标仪490nm波长下测吸光度，以OD值来表示细胞增殖活性，取平均值，统计学分析，统计方法数据以表示，两组均数比较采用t检验。

表1不同剂量山香圆叶多糖对Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖中细胞增殖活度的影响(n＝6)

注：与Ang Ⅱ组比较^**P<0.05，^*P<0.01

由表1可见，Ang Ⅱ作用细胞后OD值明显升高，与空白组比较有显著性差异(P<0.01)，山香圆叶多糖作用VSMC后OD值明显降低，与Ang Ⅱ组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，说明山香圆叶多糖对Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖有抑制作用。随山香圆叶多糖浓度增加，抑制VSMC增殖程度也逐渐增强，有明显的剂量依赖性。

实验例4

本实验例涉及本发胆提取获得的山香圆叶多糖对小鼠耳廓肿胀的抗炎作用研究

(1)实验材料

二甲苯(成都市科龙化工试剂厂，批号20130514)，阳性药：地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号140204)。

实验动物为40只SPF级雌性ICR小鼠，体重18-22g，许可证号：SCXK(湘)2011-0003，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供；实验室室温20-22℃，相对湿度40％-60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼10只。

(2)实验分组

将小鼠随机分为4组，正常组、模型组、阳性组(1.82mg/kg/d)和山香圆叶多糖组(100mg/kg/d)；正常组、模型组以等体积的生理盐水作空白对照，以地塞米松作阳性对照药物。给药体积为10mL/kg。

(3)炎症模型建立与指标检测

实验动物分组后，每日灌胃给药1次，连续给药7天。末次给药30min后，采用二甲苯致炎，1h后，取小鼠颈椎脱臼处死后，马上用眼科剪剪下小鼠双耳，用9mm打孔器分别在剪下双耳的同一部位打下圆耳片，用分析天平称重，记录各组小鼠左右耳重。以左右两耳片重量之差表示肿胀度，并比较试验组与对照组间差异的显著性。

两组数据采用T检验，多组数据采用ANOVA统计处理。数据以均数±标准误表示，P<0.05表示显著差异。

(4)结果分析

表4山香圆叶多糖对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10,)

注：与模型组比较**P<0.05，*P<0.01。

实验结果显示，山香圆叶多糖对小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用。

实施例5

本实验例涉及本发明获得的山香圆叶多糖对高果糖诱导的高血脂模型大鼠的降血脂作用研究

(1)实验材料

阳性对照药：非诺贝特片(批号：20150903)。果糖：山东西王糖业有限公司(批号：201504133)。

5周龄雄性SD大鼠36只，体重180±20g，SPF级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。许可证号：SCXK(湘)2014-0002。

基础饲料购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲料生产配方：玉米20％，豆粕18％，小麦38％，鱼粉10％，麸皮5％，豆油3％，麦芽糊精2％，预混料4％。

(2)试验方法

高果糖诱导高血脂模型法—预防性给药

在实验环境下大鼠喂饲基础饲料观察7d，进行随机分组，每天给予定量的基础饲料，正常组给予定量的蒸馏水，模型组给予相同体积的20％果糖水同时灌胃2mL生理盐水，阳性对照组给予相同体积的20％果糖水的同时灌胃阳性药物(50mg/kg/d)，实验组给予相同体积的20％果糖水的同时灌胃山香圆叶多糖(125mg/kg/d)，灌胃体积10mL/kg，于56天实验结束时禁食不禁水16小时，取血，离心(3000r/10min)分离血清。测定血清TC、TG、HDL-C血脂水平以及AST、ALT肝功能指标。

两组数据采用T检验，多组数据采用ANOVA统计处理。数据以均数±标准误表示，P<0.05表示显著差异。

(3)实验结果

表1大鼠预防性给药降血脂实验血脂指标情况(n＝9)

与模型组相比^aP<0.05，^bP<0.01。

由表1数据可以得出：经过56天的实验结束后，模型组大鼠的TC含量显著高于正常组(p﹤0.01)，模型组大鼠的TG含量显著高于正常组(p﹤0.01)，模型组大鼠的HDL-cho含量显著高于正常组(p﹤0.01)，说明成功的建立了高血脂大鼠模型；山香圆叶水提醇沉上清液组TC(p﹤0.01)、TG(p﹤0.05)、HDL-cho(p﹤0.05)含量均显著低于模型组，说明山香圆叶多糖具有一定的降低高血脂作用。

表2大鼠预防性给药降血脂实验肝功能指标情况(n＝9)

由表2数据可以得出：经过56天的实验结束后，模型组大鼠的ALT、AST含量显著高于正常组(p﹤0.01)，而山香圆叶多糖能显著降低高血脂大鼠的AST、ALT，表明其具有一定的保护高血脂大鼠肝功能的作用。

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