本发明属于食品科学与工程领域，具体涉及一种评价膳食多酚肠道益生功能的方法。
背景技术：
人体肠道特别是大肠中栖居着数量众多的微生物，其中细菌数量可达到1014个，它们在肠道中可形成一个极其复杂的生态系统，与机体健康有密切的联系。肠道微生物种类达500种以上，主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和疣微球菌门(Verrucomicrobia)6大类组成，其中以Firmicutes和Bacteroidetes为优势菌群，可占到总微生物菌群的90％以上。肠道微生物广泛参与膳食中多种营养成分的代谢，其菌群的变化与机体的健康水平密切相关。作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物本身及代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用。越来越多的研究也证实肠道菌群组成及其所产生的代谢产物可以因膳食组成的变化而改变，进而对机体的营养代谢和健康水平产生重要影响。膳食干预可以调节菌群失调，缓解代谢综合症。
膳食多酚是蔬菜、水果、谷物以及茶叶等食物中广泛存在的次级代谢产物，由于具有多个活泼羟基的化学特性，使其在自由基清除、螯合金属离子以及与特定细胞蛋白结合等生物学过程中发挥重要作用，具有抗氧化、抑菌、抗肥胖、抗炎症、抗肿瘤、保护心脑血管和神经系统等功能。膳食多酚大部分还是以固有的形式进入结肠，并与肠道微生物发生相互作用。膳食多酚进入结肠可以被其中的微生物代谢，并通过其代谢过程中肠道菌群结构变化及不同结构的代谢产物对机体产生重要影响。膳食多酚对结肠中微生物有很大的影响，具有益生的效果。多酚进入结肠后遇到微生物，多酚与结肠微生物组发生双向的相互作用：一方面，多酚能影响微生物群落组成，可能具有益生元的效果；另一方面，微生物能够转化多酚产生代谢产物。研究膳食中植物多酚在肠道微生物中的代谢和生物转化，分析其代谢产物、肠道微生物菌群变化及它们之间的相互关系已成为明确膳食多酚作用机制的重要方向。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种评价膳食多酚肠道益生功能的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：评价膳食多酚肠道益生功能，其特征在于包括以下步骤：
(1)取3名健康志愿者(三个月内未腹泻、未使用抗生素和益生菌产品，没有消化系统疾病)粪便，等量混合后，用高压灭菌的0.85％氯化钠溶液或过滤除菌的0.5g/L的半胱氨酸溶液稀释10倍，搅拌至均匀悬浮液，500转/分钟离心，取上清液，得到10％粪便菌悬液；
(2)配制含氮培养基(配方为：蛋白胨1.6g/L，酵母提取物1.6g/L，大豆分离蛋白1.0g/L，氯化钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.08g/L，硫酸镁0.01g/L，氯化钙0.01g/L，碳酸氢钠2.0g/L，氯化血红素0.02g/L，半胱氨酸0.5g/L，胆汁酸盐0.5g/L，刃天青1.0mg/L，吐温802.0mL/L，维生素K 10μL/L，pH用盐酸调节至7.0)，并在此基础上配制含不同碳源(10.0g/L，可选用的碳源包括但不局限于葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、低聚果糖、淀粉、果胶、菊糖等)的培养基；
(3)将步骤(1)得到10％粪便菌悬液按照1/9的比例分别加入步骤(2)配制的不含碳源和含有不同碳源的培养基中，每种培养体系配制6份，其中3份加入待评估的多酚样品(富含多酚的粗提物或经过纯化的多酚样品)，另外3份不加多酚样品作为对照；
(4)将步骤(3)中配置的培养体系置于厌氧手套箱或厌氧密封罐或厌氧培养罐等无氧环境中，37℃培养24小时；
(5)分别在开始培养前和培养24小时候，从步骤(4)中的培养体系中取样测定pH，使用定量聚合酶链式反应(qPCR)或荧光原位杂交(FISH)测定特定菌群数量或变性梯度凝胶电泳(DGGE)或高通量测序的方法检测群落组成，使用色谱方法(液相色谱或气相色谱)分析各培养体系中短链脂肪酸(SCFAs)的组成和含量，使用液相色谱-质谱联用分析多酚的降解产物。
本发明所述产品具有以下优点：①实验简便，采用体外模拟发酵的方式，实验时间短，取样分析方便；②评价方法科学，采用多种碳源，评估不同培养基条件下多酚的益生功能，减少碳源对测定多酚活性的影响。
附图说明
图1为膳食多酚肠道益生功能评价方法的流程图
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1：
(1)取3名健康志愿者(三个月内未腹泻、未使用抗生素和益生菌产品，没有消化系统疾病)粪便，等量混合后，用高压灭菌的0.85％氯化钠溶液或过滤除菌的0.5g/L的半胱氨酸溶液稀释10倍，搅拌至均匀悬浮液，500转/分钟离心，取上清液，得到10％粪便菌悬液；
(2)配制含氮培养基(配方为：蛋白胨1.6g/L，酵母提取物1.6g/L，大豆分离蛋白1.0g/L，氯化钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.08g/L，硫酸镁0.01g/L，氯化钙0.01g/L，碳酸氢钠2.0g/L，氯化血红素0.02g/L，半胱氨酸0.5g/L，胆汁酸盐0.5g/L，刃天青1.0mg/L，吐温802.0mL/L，维生素K 10μL/L，pH用盐酸调节至7.0)，并在此基础上配制含10.0g/L葡萄糖、蔗糖、低聚果糖和菊糖以及不含任何碳水化合物的培养基各6瓶；
(3)将步骤(1)得到10％粪便菌悬液按照1/9的比例分别加入步骤(2)配制的培养基中，每种培养体系的其中3份加入待评估的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG，5.0g/L)，另外3份不加多酚样品作为对照；
(4)将步骤(3)中配置的培养体系置于厌氧手套箱中，37℃培养24小时；
(5)分别在开始培养前和培养24小时候，从步骤(4)中的培养体系中取样测定pH，使用FISH测定Lactobacillus-Enterococcus spp、Bifidobacterium spp、Bacteroides-Prevotella、Clostridium histolyticum和Eubacterium-Clostridium数量变化，使用气相色谱分析各培养体系中SCFAs的组成，使用液相色谱-质谱联用分析多酚的降解产物。
实施例2：
(1)同实例1的步骤(1)；
(2)同实例1的步骤(2)，其中选用的碳源改为葡萄糖、乳糖、低聚果糖、果胶和菊糖；
(3)同实例1的步骤(3)，其中待评估的样品改为葡萄籽多酚(2.5g/L)；
(4)将步骤(3)中配置的培养体系置于厌氧密封罐中，37℃培养24小时；
(5)分别在开始培养前和培养24小时候，从步骤(4)中的培养体系中取样测定pH，使用高通量测序的方法测定各培养系统的菌群结构，使用气相色谱分析各培养体系中SCFAs的组成，使用液相色谱-质谱联用分析多酚的降解产物。
实施例3：
(1)同实例1的步骤(1)；
(2)同实例1的步骤(2)，其中选用的碳源改为蔗糖、乳糖、淀粉、果胶和菊糖；
(3)同实例1的步骤(3)，其中待评估的样品改为红茶提取物(10.0g/L)；
(4)将步骤(3)中配置的培养体系置于厌氧培养罐中，37℃培养24小时；
(5)分别在开始培养前和培养24小时候，从步骤(4)中的培养体系中取样测定pH，使用qPCR的方法测定各培养体系中总菌、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria、Bifidobacterium、Lactobacillus、Eubacterium和Clostridium的数量，使用液相色谱分析各培养体系中SCFAs的组成，使用液相色谱-质谱联用分析多酚的降解产物。
综上所述仅为本发明的较佳施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所做的等效变化与修饰都应为本发明的技术范畴。