一种检测北京油鸡五趾性状的方法及应用与流程

本发明涉及生物检测领域，具体的说，涉及一种检测北京油鸡五趾性状的方法及应用。

背景技术：

北京油鸡是我国一个著名的地方品种，原产于北京地区，该鸡种肉蛋品质优良，深受养殖户和消费者欢迎，现已被农业部列入国家畜禽品种资源重点保护名录。近年来在北京市和全国大部分省市都有推广，并且养殖量和养殖规模逐年上升。该鸡外貌独特，具有五趾和三毛(凤头、胡须、毛腿)的特征。

其中，五趾是北京油鸡屠宰上市后最明显的辨认性状，可以作为北京油鸡的重要品种标识，帮助消费者籍此做出消费选择。因此加强北京油鸡五趾性状的选育，无论从促进品种本身开发而言，还是从养殖者和消费者而言，都具有重要意义。

然而，鸡的五趾是一个相对复杂的质量性状，呈不完全显性遗传，通过趾数的表型来选择进展非常缓慢，很难获得显著的效果。

2010年，Dorshorst等在Siklie和WhiteSultan鸡种中检测到LMBR1基因第5内含子内ZRS区域内突变rs80659072与五趾有关，其中GG型表现为四趾，GT和TT型表现为五趾或更多趾。2016年，Zhang等也表示该位点与北京油鸡多趾是完全相关的，并建立了基于酶切的PCR-RFLP方法对该位点进行检测(专利申请号201510044061.2)。

然而，该聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)方法检测步骤复杂，包括：①根据酶切位点上下游序列设计引物，利用聚合酶链式反应扩增目的片段；②扩增产物的琼脂糖凝胶检测；③扩增产物的限制性内切酶消化；④酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测。不仅步骤繁琐、耗时长，而且要多次的转管和加样，且DNA浓度、DNA质量、扩增条件、内切酶消化条件、琼脂糖凝胶质量等都会影响到判型的有效性和准确性。

在北京油鸡五趾性状的实际选育过程中，要求能够快速检测出基因型，且结果必须保证准确性，因为一旦判定错误，会给育种带来重大损失。因此，开发出一种能够快速准确检测北京油鸡五趾性状的方法，以此为北京油鸡的选育提供有力的技术支撑尤为必要。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的采用PCR-RFLP方法检测北京油鸡五趾性状存在的步骤繁琐，耗时长，灵敏度低，检测结果易受实验条件影响的缺陷问题，提供一种能够准确高效地检测北京油鸡五趾性状的荧光定量PCR方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

首先本发明提供了一种检测北京油鸡五趾性状的方法，该方法包括通过实时荧光定量PCR技术检测LMBR1基因第5内含子内ZRS区域内的rs80659072突变位点的基因型的步骤。

优选的，上述方法包括根据LMBR1基因第5内含子内ZRS区域的序列，设计一对荧光定量PCR引物以及与引物配合使用的TaqMan探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术检测rs80659072突变位点的基因型的步骤；

其中，所述的LMBR1基因第5内含子内ZRS所在区域的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明一个优选的方面，所述荧光定量PCR的引物为：用于扩增ZRS区域的荧光定量PCR引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；和

与上述PCR引物配合使用的TaqMan荧光探针核苷酸序列为：野生型等位基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，突变型等位基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，上述荧光定量PCR的反应体系是：基因组DNA 1μL，40倍浓缩的探针和引物混合液0.25μL，通用PCR混合液5μL，用水补齐至10μL。

优选的，上述荧光定量PCR的反应条件是：95℃，预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

本发明提供了一种用于鉴定北京油鸡五趾性状的引物，其是用于扩增ZRS区域的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

进一步地，本发明还提供了一种与上述的PCR引物配合使用的TaqMan荧光探针，其包括野生型等位基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；突变型等位基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含上述的引物和上述荧光探针的组合。

优选的，本发明所述的试剂盒在检测北京油鸡五趾性状上的应用。

更进一步地，本发明还提供了将上述北京油鸡五趾性状检测方法应用于选育北京油鸡五趾性状上。

本发明通过设计特异性的引物对以及与引物对配合使用的探针，采用实时荧光定量TaqMan SNP分型技术检测目的序列的基因型。采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测鸡目标区域突变位点的基因型，并且在此基础上借助分子标记辅助进行育种，能够快速构建北京油鸡五趾品系纯系。并且，本发明使用的实时荧光定量TaqMan SNP分型技术检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，经过一个PCR反应即可判型，操作简便，且反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。能够以满足育种工作对准确性和及时性的要求。

此外，本发明使用的与特异性的引物对配合使用的探针是TaqMan MGB探针，该探针的3′端的淬灭基团是不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，因此当淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰；TaqMan MGB探针还具有更强的序列特异性，实验结果更精确可靠。

附图说明

图1为部分个体PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1-10为不同个体，泳道M为100bp Marker；

图2为荧光定量PCR法检测个体的基因型；

图3为不同基因型个体测序结果。

具体实施方式

目前检测北京油鸡多趾的方法是基于酶切的PCR-RFLP方法对与北京油鸡五趾相关位点的基因型进行检测，该方法不仅步骤繁琐、耗时长，而且准确性不能够满足后期构建北京油鸡五趾品系纯系的要求，本发明为了克服上述缺陷，提供一种利用实时荧光PCR技术高效地检测北京油鸡五趾性状的方法。

下面结合具体实施例对本发明进行说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴：

实施例1突变位点rs80659072的检测

参考突变位点rs80659072(NCBI登录号)及其周围序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)，设计引物，上游引物：5’-ACATACCAAGAATGTGCATGTGC-3’,下游引物：5’-TTTGAGGTAACTTCCTTGCTTAA-3’，扩增产物长度448bp。

从北京油鸡大群中随机选择各种趾型的个体，累计155只。采集抗凝血，使用DNA提取试剂盒(天根生化，北京)提取基因组DNA，使用上述引物该位点及其周围序列进行PCR扩增。扩增产物经2％琼脂糖凝胶检测后，由北京擎科嘉美生物技术有限公司完成测序，反向测序。

图1给出了上述的部分个体的PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中泳道8和10对应个体的产物非常弱，无法用于后续的测序试验。使用NanoDrop2000紫外分光光光度计，测定基因组浓度，发现这4只个体DNA浓度较低，只有10-15ng/μL。DNA模板添加量增加到5μL，重新PCR扩增，但是仍然达不到理想的PCR产物扩增浓度。因此，重新对这4只个体提取基因组DNA后，再重新PCR扩增才获得了满意的结果。

所有155只鸡的测序结果见表1：由表1可以看出除了双四趾(4/4)的油鸡外，其余无论哪种表型，左五-右四(5/4)、左四-右五(4/5)、双五趾(5/5)、六趾(包括双六趾和单六趾，6/-)，都只有TT和GT两种基因型。结果表明，T位点是北京油鸡五趾/六趾表型的一个必要条件，但不是充要条件。

表1不同表型油鸡rs80659072突变位点基因型分布

实施例2荧光定量PCR检测方法的建立

本发明经反复的比对筛选和验证，根据LMBR1基因第5内含子内ZRS区域及其附近的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)得到一对用于检测鸡rs80659072突变位点的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的TaqMan探针。

上游引物F：5’-TCAGTGGCAAAAAACGAGCAAAAAT-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物R：5’-CACACAGAAATGAGTAGGAAGTCCAA-3’(SEQ ID NO.2)。

上游引物由25个碱基组成，对应鸡2号染色体8467207～8467231碱基位置(www.ensembl.org，galgal4)，下游引物由26个碱基组成，对应鸡2号染色体8467272～8467299碱基位置(www.ensembl.org，galgal4)，该引物对的扩增片段长度为93bp。

与上述特异性引物配合使用的TaqMan荧光探针核苷酸序列为：

野生型等位基因探针：5’-ATGCAATGAAAGCTC-3’(SEQ IN NO.3)；

突变型等位基因探针：5’-CATGCAATTAAAGCTC-3’(SEQ IN NO.4)。

野生型探针由15个碱基组成，突变型探针由16个碱基组成，对应2号染色体第8467241～8467255和8467240～8467255位碱基序列。其中，野生型等位基因的探针针对野生型碱基G，探针5’端连接了荧光基团VIC。突变型等位基因的探针针对突变碱基T，探针5’端连接了荧光基团FAM；两个探针的3’端标均标记有淬灭基团，该基团为不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)。

使用伯乐(Bio-Rad)iQ5型实时荧光定量PCR仪进行TaqMan探针实时荧光定量PCR试验。

以上述实施例1中已知基因型的155个体的基因组DNA为模板，建立TaqMan荧光定量PCR检测方法。反应体系如下：

其中，基因组DNA为实施例1中获得的基因组DNA，40×SNP Genotyping AssayMix(上、下游引物浓度各36μM和探针浓度各8μM)由ABI(美国)合成，购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)，Genotyping Master Mix由ABI(美国)合成，购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，ddH2O为灭菌去离子水。

PCR反应条件：95℃，预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环，实时检测整个扩增中两种荧光染料的信号强度。

在检测过程中每种反应体系都设置2个不加模板DNA的空白对照，以方便软件对背景色进行校正。

反应结束后，还可以使用仪器自带软件，data analysis模块中的Allelic Disc功能界面直接进行判型，判型结果见图2：

通过图2，可以看出相同基因型的个体聚类在一起，其中，正方形代表的是TT纯合子；三角形代表的是GT杂合子；圆形代表的是GG纯合子。

不同基因型个体的反向测序结果见图3，a)在箭头所指突变位点处只有一个峰，对应A碱基，因为是反向测序，所以对应个体的基因型为TT突变型，b)在箭头所指突变位点处有2个峰，对应A、C两种碱基，因为是反向测序，所以对应个体基因型为GT型，为杂合子；c)在箭头所指突变位点处有一个峰，对应碱基为C，因为是反向测序，所以对应个体的基因型为GG，野生型。

综上结果表明，对155个个体用Taqman探针法检测结果与已知PCR产物测序结果对比显示二者完全一致，说明TaqMan探针实时荧光定量PCR方法准确可靠。

本发明所提供的方法对155个个体进行检测时，使用96孔板，只用了两块PCR板子即完成了对结果的判定。耗时仅4-5小时。并且包含在实施例1中出现的4个无法完成扩增的，这主要是因为TaqMan SNP分型方法对基因组的要求比较低，从10-100ng都可以满足需要，即使基因组浓度非常低或者提取质量略差，都无需重新提取基因组，且不会影响对检测分型结果的判定。

而如果采用实施例1的PCR产物直接测序的方法或者PCR-RFLP的方法，都对基因组有很高的要求，否则PCR扩增不稳定，或者产物量过少，影响后续的酶切和测序工作。此外，除了PCR扩增步骤外，PCR产物直接测序的方法或者PCR-RFLP的方法，还需要增加测序或者酶切的步骤，耗时至少增加10小时以上。所以本发明TaqMan SNP分型方法具有非常明显的优势。

实施例3不同趾数表型和基因型鸡的遗传规律研究

分别选择不同趾数表型和不同基因型组合的公鸡母鸡交配，研究不同基因型的遗传规律。具体实验操作如下：

(1)双四趾表型：7只GG型公鸡，与20只GG型母鸡交配；3只TT公鸡，与7只TT母鸡，7只GT母鸡；(2)双五趾表型：8只TT公鸡，与20TT母鸡和6只GT母鸡；两只GT公鸡和2只GT母鸡。

分别对上述交配类型的后代进行趾型的观察登记。结果见表2：

表2不同趾数表型和基因型鸡交配后代趾型结果

通过表2可见CC型与CC型的后代，100％都是双四趾，该试验结果充分说明，如果GG基因型的公鸡和母鸡交配，则后代完全为双四趾个体。

而AA与AA或者AC型的后代大多数表现为双五趾，具体分析如下：

趾数表型为双四趾的TT型与TT型或者GT型鸡交配，其后代仍会出现较高比例的五趾鸡，双五趾比例63％左右，单五趾比例19％左右，当然，群体中仍然存在18％左右比例的双四趾个体。

然而，即使是双五趾的TT型与TT型或者GT型鸡交配，后代仍会出现低比例的双四趾表型，约4％。

也就是说，可能存在一些抑制因子会抑制其表达，但是并不会影响五趾的遗传。突变位点rs80659072可以作为一个北京油鸡五趾性状候选标记在育种中进行应用，虽然后代并不一定全部表现为五趾，但是会大大提高群体后代五趾表型的比例。