一种MAOAμ‑VNTR荧光标记自动分型方法与流程

本发明涉及荧光标记引物分型领域，尤其是一种MAOAμ-VNTR荧光标记自动分型方法。

背景技术：

目前国内外学者关于MAOAμ-VNTR多态性研究多集中在酒精依赖、精神分裂症、抑郁症、暴力攻击行为等方面，探讨两者的相关性，阐明其发生的遗传机制，为疾病或者暴力预防与控制，风险预测以及针对酒精依赖、暴力攻击行为的相关药物设计提供理论基础，具有重要社会经济意义。但是目前针对MAOAμ-VNTR多态性的研究报道中，大多采用PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳，基因分型依赖人工判读，准确性依赖个体经验，存在一定的误差；而且电泳时间长。

因此，对于上述问题有必要提出一种MAOAμ-VNTR荧光标记自动分型方法。

技术实现要素：

本发明目的是克服了现有技术中的不足，提供一种MAOAμ-VNTR荧光标记自动分型方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现：

一种MAOAμ-VNTR荧光标记自动分型方法，其方法步骤为：(1)样本及DNA提取；(2)PCR扩增；(4)3130型遗传分析仪进行毛细管电泳；(4)GeneMapper IDv3.2软件进行VNTR分型。

优选地，所述样本及DNA提取还包括720份云南汉族无关个体的指尖血,一部分取自于本实验室日常检案,另一部分取自红河州看守所羁押人员，使用FTA卡或中速滤纸采集,用chelex-100法进行DNA提取。

优选地，所述PCR扩增包括用BIO-RAD T100^TM梯度PCR仪优化选择PCR反应条件,最终确定扩增反应体积为10μL,内含1～10ngDNA模板,PCR混合物(天根)5μL,0.8μmol/L PCR引物,正向引物:5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，反向引物:5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'，且正向引物5'端用FAM荧光标记；所述扩增反应的循环参数为:95℃5min预变性,94℃30s,60℃30s,72℃40s,循环30次,最后延伸为72℃5min。

优选地，所述3130型遗传分析仪进行毛细管电泳包括取Hi-Di甲酰胺1000μL加入1.5mlEP管，再加入GS-500LIZ分子量标记60μL，反复混匀，每孔加两者的混合物9μL。加样后打开3130型遗传分析仪，将样品板放入仪器内的托盘内。

优选地，其使用方法为(1)点击打开3130Foundation Data Collection3.0软件；(2)在Plate manager窗口编写样品表；(3)然后切换到Run Scheduler的plate view窗口，找到待电泳的样品表并与放样品的样品盘链接：(4)点击上方的三角形进行电泳。

优选地，所述GeneMapper IDv3.2软件进行VNTR分型包括新建Panel、新建GeneMapper Manager、新建Size Standards和点击打开GeneMapper IDv3.2软件。

优选地，所述新建Panel其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中Panel Manager,在跳出的窗口的File下拉菜单中点击New Kit，编辑、分析方法名如MAOA,选中MAOA，新建New Marker编辑片段名、大小区域。

优选地，所述新建GeneMapper Manager其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中点击analysis method点击New命名如MAOA，选中编好的Panel,点OK。

优选地，所述新建Size Standards其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中点击Size Standards点击New命名如MAOA-liz,根据PP试剂盒的LIZ进行编写，点击OK。

优选地，所述点击打开GeneMapper IDv3.2软件进一步包括在跳出的窗口的File下拉菜单中点击Add Samples to Project,在新跳出的窗口中找到待分析的文件名并点击，这时左下角Add to List按钮变蓝，点击，Samples To Add栏出现待分析的文件名，点击右下角变蓝的Add按钮，待分析的样品就出现在新跳出的窗口中；在Panel列选择所应用的扩增系统，在Size Standard列选择所应用的电泳程序，在Analysis Method列选择分析的条件，然后点击分析，得到数字化的VNTR基因分型。

本发明的有益效果是：建立的MAOAμ-VNTR多态性荧光标记自动分型方法分型效率高，全自动毛细管电泳能更准确的进行MAOAμ-VNTR基因分型，且具有样品处理简单、自动化程度高、检测时间短等优势,结果准确可靠，操作简便，在针对MAOAμ-VNTR多态性的相关研究中具有良好的应用前景。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的方法流程示意图；

图2是本发明GeneMapper IDv3.2软件进行VNTR分型使用流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以有权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

如图1所示,一种MAOAμ-VNTR荧光标记自动分型方法，其方法步骤为：(1)样本及DNA提取；(2)PCR扩增；(4)3130型遗传分析仪进行毛细管电泳；(4)GeneMapper IDv3.2软件进行VNTR分型。

进一步的，所述样本及DNA提取还包括720份云南汉族无关个体的指尖血,一部分取自于本实验室日常检案,另一部分取自红河州看守所羁押人员，使用FTA卡或中速滤纸采集,用chelex-100法进行DNA提取。

进一步的，所述PCR扩增包括用BIO-RAD T100^TM梯度PCR仪优化选择PCR反应条件,最终确定扩增反应体积为10μL,内含1～10ngDNA模板,PCR混合物(天根)5μL,0.8μmol/L PCR引物,正向引物:5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，反向引物:5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'，且正向引物5'端用FAM荧光标记；所述扩增反应的循环参数为:95℃5min预变性,94℃30s,60℃30s,72℃40s,循环30次,最后延伸为72℃5min。

进一步的，所述3130型遗传分析仪进行毛细管电泳包括取Hi-Di甲酰胺1000μL加入1.5mlEP管，再加入GS-500LIZ分子量标记60μL，反复混匀，每孔加两者的混合物9μL。加样后打开3130型遗传分析仪，将样品板放入仪器内的托盘内。

进一步的，其使用方法为(1)点击打开3130Foundation Data Col lection3.0软件；(2)在Plate manager窗口编写样品表；(3)然后切换到Run Scheduler的plate view窗口，找到待电泳的样品表并与放样品的样品盘链接：(4)点击上方的三角形进行电泳。

实施案例一，所述GeneMapper IDv3.2软件进行VNTR分型包括新建Panel、新建GeneMapper Manager、新建Size Standards和点击打开GeneMapper IDv3.2软件。所述新建Panel其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中Panel Manager,在跳出的窗口的File下拉菜单中点击New Kit，编辑、分析方法名如MAOA,选中MAOA，新建New Marker编辑片段名、大小区域。所述新建GeneMapper Manager其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中点击analysis method点击New命名如MAOA，选中编好的Panel,点OK。所述新建Size Standards其使用方法为点击Tools在下拉菜单中选中GeneMapper Manager,在跳出的窗口中点击Size Standards点击New命名如MAOA-liz,根据PP试剂盒的LIZ进行编写，点击OK。所述点击打开GeneMapper IDv3.2软件进一步包括在跳出的窗口的File下拉菜单中点击Add Samples to Project,在新跳出的窗口中找到待分析的文件名并点击，这时左下角Add to List按钮变蓝，点击，Samples To Add栏出现待分析的文件名，点击右下角变蓝的Add按钮，待分析的样品就出现在新跳出的窗口中；在Panel列选择所应用的扩增系统，在Size Standard列选择所应用的电泳程序，在Analysis Method列选择分析的条件，然后点击分析，得到数字化的VNTR基因分型。

全自动毛细管电泳法不需要进行标本预处理,省却了洗涤红细胞的过程,且自动化程度高,操作过程最大程度的减少了人为误差。全自动毛细管电泳法与琼脂糖凝胶电泳法相比,具有以下优点:(1)琼脂糖凝胶电泳需要EB染色,在紫外灯下显示橘黄色条带，基因分型依赖人工判读，准确性依赖个体经验，而全自动毛细管电泳荧光标记引物，通过GeneMapper IDv3.2软件自动分型。(2)本研究发现全自动毛细管电泳可以一次性检测96个样本，而琼脂糖凝胶电泳最多可检测30个样本，具有检测时间短的优点,节省了大量的人力物力。(3)琼脂糖凝胶电泳需要制胶、点样、电泳、染色等过程，操作繁琐，点样技术要求熟练准确，电泳耗时长，耗时耗力，而全自动毛细管电泳省去制胶、染色过程，操作简便。

本发明的有益效果是：建立的MAOAμ-VNTR多态性荧光标记自动分型方法分型效率高，全自动毛细管电泳能更准确的进行MAOAμ-VNTR基因分型，且具有样品处理简单、自动化程度高、检测时间短等优势,结果准确可靠，操作简便，在针对MAOAμ-VNTR多态性的相关研究中具有良好的应用前景。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。