一种鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记的制作方法

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记。

背景技术：

长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。形态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响，具有表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定；并且形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。

本专利利用高通量测序手段对不同鸡种进行测序，通过对不同鸡种间的DNA序列进行筛查比对，发现在不同鸡种间出现的特异性序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩增和重测序验证，以期通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以对不同鸡种进行更精确的分类。

技术实现要素：

为了解决根据形态学标记对鸡种进行鉴定的方法受环境因素影响较大，而且通过形态学进行的分类和鉴定出的结果容易出现错误的问题；本发明提供了一种鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记，应用分子标记这种分子生物学手段可以根据不同鸡种间的序列差异对鸡种进行更精确的分类与鉴定。

本发明通过目标区域捕获测序筛查不同鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo等软件设计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证，根据分析结果可以得到鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记。

本发明所述的鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记，其序列如SEQ ID NO.4所示，共240bp。

所述分子标记的引物序列如SEQ ID NO.2和3所示。其他鸡种用引物序列如SEQ ID NO.2和3扩增，其扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.1相比，SEQ ID NO.4存在特异性的22个碱基的缺失(CATGCACTGAGGATGAGCTGCC)。

本发明还提供了一种鉴定泰和乌骨鸡的方法，是利用上述引物，以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，根据扩增产物的长度判定待鉴定样本是否为泰和乌骨鸡。进行测序验证，如果扩增产物序列为240bp,即存在22bp的碱基缺失，则为泰和乌骨鸡。其余鸡种则无此特点。由于4％的琼脂糖凝胶电泳，可以看出泰和乌骨鸡的电泳条带位于其它鸡种条带的下方，但由于分离效果不够准确，还需进行测序验证。以测序结果中存在22bp的碱基缺失为判定标准。

根据结果得到的这种分子标记，为一段DNA序列。泰和乌骨鸡与其他鸡种在这段序列上存在特异性差异，根据这段序列差异，可以从不同鸡种中鉴别出泰和乌骨鸡。应用此分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，将为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添新的科学依据。

附图说明

图1：是泰和乌骨鸡与其他鸡种序列示意图。

图2：泰和乌骨鸡与其他鸡种琼脂糖凝胶电泳图。图中条带1，22为泰和乌骨鸡，分子量240bp，条带2-21分别为罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如皋黄鸡、固始鸡、藏鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、斗鸡×罗斯杂交1代、太湖鸡、溧阳鸡；条带23-28为绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡，分子量为262bp。

具体实施方式

实施例

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如皋黄鸡、固始鸡、藏鸡、泰和乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、斗鸡×罗斯杂交1代、太湖鸡、溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡27种，其中仙居鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、白耳鸡、藏鸡、固始鸡、大骨鸡、河南斗鸡、狼山鸡、泰和乌骨鸡、萧山鸡、北京油鸡12个地方鸡品种均来自中国农业科学院家禽研究所国家地方禽种资源基因库，红色原鸡亚种采自云南省野生动物救护中心。其余14个鸡品种样本来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室。

1.2 目标捕获测序

每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0.4mL，肝素钠抗凝，加入裂解液后4℃保存备用。利用苯酚抽提法提取DNA，送入华大基因公司(BGI)进行目标捕获测序，选取Gallus_gallus-4.0作为参考基因组。对目标捕获测序得出的初始数据，首先去除reads中的接头污染，然后将reads中超过50％的低质量碱基去除(quality value≤5(E))，确保分析数据的高质量性。

1.3 序列比对

目标捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5.1对不同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况。

1.4 引物设计

根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列，此序列位于鸡的16号染色体的TAP2基因上，基因登录号为427728。具体序列SEQ ID NO.1，其中125-146的22bp为为泰和乌骨鸡缺失的序列。

利用不同鸡种DNA作为模板，利用Oligo6.0软件设计引物进行PCR扩增，引物序列为：

1.5 PCR扩增和检测

PCR扩增总体积为20μL：1μL DNA模板(100ng/μL)，2μL 10×PCR Buffer，1.5μL dNTP(10m mol/L)，上下游引物各1μL(10p mol/μL)，Taq酶为0.2μL(5U/μL)，ddH₂O 13.3μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用。把PCR产物送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序并用4％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为100V，电泳40min。

2 结果

通过目标捕获测序，发现泰和乌骨鸡与其他鸡种存在差异的一段序列，设计引物PCR扩增并进行重测序验证，泰和乌骨鸡与其他鸡种存在的特异性差异在于在这段序列上泰和乌骨鸡存在特异性的22bp缺失(CATGCACTGAGGATGAGCTGCC)，其他鸡种无此特点(见附图1)。通过琼脂糖凝胶电泳也可清晰鉴别(见附图2)。因此，这段序列可以作为一种鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记。应用此分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，将为家禽品种资源的保存和合理利用增添新的科学依据。