一种榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法与流程

本发明涉及害虫生物防治技术领域，特别是一种榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法。

背景技术：

榕母管蓟马Gynaikothrips ficorum(Marchal)隶属于缨翅目Thysanoptera蓟马科(Thripidae)，是出口盆栽榕树上的主要害虫。目前，该虫的防控偏重于使用化学农药，易造成“3R”和药害问题。生物防治是一种安全、有效、持久的控害方法，且虫生真菌挖掘利用已是害虫生防的重要发展方向之一。蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii(Zimmermann)Zare&Gams是一种地理分布和寄主范围均比较广泛的昆虫病原真菌，在国内外已有一些高效菌株被筛选用于西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)、棕榈蓟马Thrips palmi Karn和烟蓟马T.tabaci Lindeman等的生物防治，但尚未见对榕母管蓟马高效防控菌株的筛选报道。传统的生防菌株筛选方法是对目标害虫进行毒力测定，但鉴于蜡蚧轮枝菌的来源多样性及其对目标害虫的毒力大小不同，若将每种不同来源的菌株一一对榕母管蓟马进行毒力测定，不仅筛选工作量大，而且受供试虫源饲养时间的制约；因此，有必要寻找一种用于榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法，以提高筛选效率。

菌株生物学特性是影响虫生真菌毒力的主要因素之一，目前有研究人员通过建立菌株生物学特性与毒力的回归方程，分析他们之间的相关性，以求证虫生真菌的某些生物学特性是否可作为评判菌株对目标害虫毒力大小的初筛指标；如雷妍圆等(2010)发现，球孢白僵菌Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin对小菜蛾Plutella xylostella(L.)的致病力与菌株产孢量呈极显著相关(中国生物防治，CN：11-5973/S)，玫烟色棒束孢Isariafumosorosea(Wize)Brown et Smith对小菜蛾的致病力与菌株生长速率、产孢量和孢子萌发率呈极显著相关(植物保护学报，CN：11-1983/S)；黄大庆等(2004)和王成树等(1998)分别发现，球孢白僵菌菌株对马尾松毛虫Dendrolimus punctatus Walker的LT50与菌株产孢量和孢子萌发中时呈极显著相关(宿州师专学报，CN：CN34-1289/Z和森林病虫通讯，CN：21-1161/S)；Altre等(1999)发现，玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown et Smith对小菜蛾的致病力与菌株孢子的萌发中时呈显著正相关(Journal of Invertebrate Pathology，ISSN：0022-2011)。这些研究均表明，虫生真菌生长速度快慢、产孢量大小、孢子萌发率高低和萌发速度快慢与菌株毒力存在一定的相关性，可作为评判菌株对目标害虫毒力大小的初筛指标。据此，本发明通过建立类似的回归方程，分析蜡蚧轮枝菌生物学特性与菌株对榕母管蓟马毒力的相关性，从中筛选出某些生物学指标用于榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛，为利用虫生真菌防控榕母管蓟马等害虫提供更多的技术支持。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提出一种榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法，能快速筛选出对榕母管蓟马具有控制和应用潜能的优质高效菌株，减轻筛选工作量，节省筛选工作时间，提高筛选效率，对利用虫生真菌防控榕母管蓟马等害虫具有重要意义。

本发明采用以下方案实现：一种榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法，具体包括以下步骤：

步骤S1：选择供试菌株，观察所述供试菌株的生物学特性指标，所述生物学特性指标包括生长速度、产孢量、孢子萌发率和孢子萌发中时GT₅₀等；

步骤S2：测定所述供试菌株对榕母管蓟马成虫毒力指标；所述毒力指标包括所述供试菌株对榕母管蓟马成虫的致死中时LT₅₀以及榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率；

步骤S3：构建得2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程，筛选出2个作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的快速初筛指标；

其中，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程为：

y₁＝-1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂；

y₂＝175.8298-23.8111x₁-9.0535x₂；

其中，所述x₁为供试菌株的生长速度，x₂为孢子萌发中时GT₅₀，y₁为榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率，y₂为供试菌株的致死中时LT₅₀；

其中，所述2个作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的快速初筛指标为x₁与x₂。

进一步地，所述供试菌株包括蜡蚧轮枝菌V07、蜡蚧轮枝菌V16063、蜡蚧轮枝菌V3450和蜡蚧轮枝菌Vp28。

进一步地，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程的相关系数分别为0.9993和0.9962，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程的显著性检验分别为0.0222和0.0406，均小于0.05，达显著水平。

进一步地，x₁与y₁呈极显著正相关，其偏相关系数为0.9960，显著性检验为0.0079，小于0.01；x₂与y₁呈显著正相关，其偏相关系数为0.9928，显著性检验为0.0142，小于0.05；x₁、x₂均与y₂呈显著负相关，其偏相关系数分别－0.9886和－0.9828，显著性检验分别为0.0224和0.0335，均小于0.05。

较佳的，所述2个最优回归方程和2个快速初筛指标，在供试菌株高产孢量和高孢子萌发率，且相互之间差异不显著的情况下，可用于榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛；而对于低产孢量和低孢子萌发率的菌株，无需经过方程评判，可直接淘汰。

与现有技术相比，本发明有以下有益效果：本发明可使不同来源的蜡蚧轮枝菌菌株，无需一一对榕母管蓟马进行毒力测定，即可淘汰大部分低效或无效的菌株，快速筛选出对榕母管蓟马具有控制和应用潜能的优质高效菌株，减轻菌株筛选工作量和节约筛选工作时间一半以上，且不受供试虫源饲养时间的制约，有效地提高了榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的筛选效率，可为榕母管蓟马其他优质高效生防菌株的快速初筛提供参考。

附图说明

图1为本发明实施例中榕母管蓟马成虫受蜡蚧轮枝菌菌株V07侵染后的死亡趋势示意图。

图2为本发明实施例中榕母管蓟马成虫受蜡蚧轮枝菌菌株V16063侵染后的死亡趋势示意图。

图3为本发明实施例中榕母管蓟马成虫受蜡蚧轮枝菌菌株V3450侵染后的死亡趋势示意图。

图4为本发明实施例中榕母管蓟马成虫受蜡蚧轮枝菌菌株Vp28侵染后的死亡趋势示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

本实施例提供了一种榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛方法，具体包括以下步骤：

步骤S1：选择供试菌株，观察所述供试菌株的生物学特性指标，所述生物学特性指标包括生长速度、产孢量、孢子萌发率和孢子萌发中时GT₅₀等；

步骤S2：测定所述供试菌株对榕母管蓟马成虫毒力指标；所述毒力指标包括所述供试菌株对榕母管蓟马成虫的致死中时LT₅₀以及榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率；

步骤S3：构建得2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程，筛选出2个作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的快速初筛指标；

其中，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程为：

y₁＝-1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂；

y₂＝175.8298-23.8111x₁-9.0535x₂；

其中，所述x₁为供试菌株的生长速度，x₂为孢子萌发中时GT₅₀，y₁为榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率，y₂为供试菌株的致死中时LT₅₀；

其中，所述2个作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的快速初筛指标为x₁与x₂。

在本实施例中，所述供试菌株包括蜡蚧轮枝菌V07、蜡蚧轮枝菌V16063、蜡蚧轮枝菌V3450和蜡蚧轮枝菌Vp28。

在本实施例中，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程的相关系数分别为0.9993和0.9962，所述2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程的显著性检验分别为0.0222和0.0406，均小于0.05，达显著水平。

在本实施例中，x₁与y₁呈极显著正相关，其偏相关系数为0.9960，显著性检验为0.0079，小于0.01；x₂与y₁呈显著正相关，其偏相关系数为0.9928，显著性检验为0.0142，小于0.05；x₁、x₂均与y₂呈显著负相关，其偏相关系数分别－0.9886和－0.9828，显著性检验分别为0.0224和0.0335，均小于0.05。

较佳的，在本实施例中，所述2个最优回归方程和2个快速初筛指标，在供试菌株高产孢量和高孢子萌发率，且相互之间差异不显著的情况下，可用于榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛；而对于低产孢量和低孢子萌发率的菌株，无需经过方程评判，可直接淘汰。

下面通过室内试验对本实施例作进一步的描述和说明，以解决本实施例中2个代表供试菌株生物学特性与毒力关系的最优回归方程的构建及2个可作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的快速初筛指标的获得问题。

1、材料与方法

(1)供试菌株和虫源选取

供试菌株为蜡蚧轮枝菌V07、V16063、V3450和Vp28菌株由福建农林大学植物保护学院提供，菌种保存与活化均采用察氏培养基，在光照培养箱内的活化和培养条件为温度(25±1)℃、相对湿度90％±5％、光周期L︰D＝14︰10、光照强度(2000±50)Lx；供试榕母管蓟马为成虫，采集于福建省漳州市漳浦县的盆栽榕树种植基地，在温度(26±2)℃、相对湿度60％±5％、光周期L︰D＝8︰16、光照强度(10000±50)Lx条件下，用特制养虫瓶(专利号：ZL 2012 1 0018430.7)和当年新抽垂叶榕嫩枝条(枝条上有3张以上嫩叶)饲养13～15代，建立稳定种群后备用。

(2)供试菌株生物学特性观察

取保存的4株蜡蚧轮枝菌菌株接种到9cm的察氏培养基平板上，活化培养10d后用无菌打孔器分别在4株活化菌株的培养皿内打取直径5mm的菌苔，菌丝面朝下接种于直径9cm的察氏培养基平板上，每株菌株各接5个培养皿，置于光照培养箱内培养，每天下午15︰00采用十字交叉法测量每株菌株菌落直径的增长量，连续测量10d，计算每株供试菌株的生长速度；然后往每个培养皿中加入10mL的0.05％吐温-80无菌水作为润湿剂洗脱并收集分生孢子，经3层脱脂纱布过滤除去菌丝和杂质得孢子原液，用纽鲍尔血细胞计数在400倍的倒置生物显微镜下，统计每个培养基的产孢量；再将每株菌株的5份孢子原液均稀释300倍，各取1mL孢子悬浮液均匀涂布于5份2％水琼脂平板培养基上，后置于相同条件的光照培养箱内培养，每3h用400倍的倒置生物显微镜随机观察每个培养基3个视野，每个视野至少20个孢子，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发数，15h后计算4株菌株的孢子萌发率并估测孢子萌发中时(GT₅₀)。

(3)供试菌株对榕母管蓟马的毒力测定

取活化后的4株供试菌株，然后往每个活化培养皿中加入10mL的0.05％吐温-80无菌水作为润湿剂洗脱并收集分生孢子，计算孢子原液的浓度，再用无菌水将每份孢子原液分别稀释成1.00×10⁴，1.00×10⁵，1.00×10⁶，1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1等5个处理浓度，以0.05％吐温-80无菌水为对照，共6个处理，每个处理3次重复。取直径9cm的培养皿，依次铺入1片相同直径的花泥和滤纸，花泥厚0.5cm、吸水8mL，在滤纸上再放1片带叶柄的垂叶榕嫩叶，叶柄用湿棉花包裹并与滤纸紧贴，共72个培养皿，每株菌株分得18个培养皿，均匀分成6组。用软毛笔刷挑取同一日龄的榕母管蓟马成虫，每株菌株每个处理均挑90头，在各自处理液中浸泡10s，待虫体略干时再挑到叶片上，每皿挑30头后用保鲜膜封口，并用0.27mm的昆虫针在保鲜膜上密扎细孔通气；将培养皿置于光照培养箱内培养，每天下午15︰00观察、记录死亡数，连续观察10d，并将死亡虫体挑入察氏培养基平板上，再置于相同条件的光照培养箱中培养、观察，以死亡虫体长出菌丝计为有效感染，统计榕母管蓟马成虫的死亡数，计算累计校正死亡率，估测每株菌株的致死中时(LT₅₀)。

(4)数据统计与分析

利用DPS 7.05数据处理软件，采用Tukey检验法对4株蜡蚧轮枝菌菌株生长速度、产孢量和孢子萌发率进行多重比较；采用机率值分析法，估测比较4株供试菌株孢子的GT₅₀及菌株对榕母管蓟马成虫的LT₅₀；采用逐步回归分析法，分析供试菌株生物学特性与毒力(1.00×10⁸mL^-1处理)的相关性，构建最优回归方程。

2、结果与分析

(1)4株供试菌株的生物学特性

由表1可知，V16063、V3450和Vp28菌株生长较快，菌株生长速度在4.68～4.94mm/d间，相互间差异不显著；V07菌株生长最慢，与其他3株菌株的差异显著。4株菌株产孢量均很多，每皿达4.25×10⁹～6.04×10⁹，其中V3450菌株最多，依次为V16063、Vp28和V07菌株，菌株间略存差异但差异不显著。4株菌株孢子萌发率均很高，高达95.91％～97.07％，其中Vp28菌株最高，依次为V3450、V07和V16063菌株，菌株间存差不显著。V3450菌株孢子GT₅₀最短，为5.86h，显著短于其他3株菌株；V07菌株孢子GT₅₀最长，与其他3株菌株差异显著。

表1 4株蜡蚧轮枝菌菌株的生物学特性

注：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

(2)4株供试菌株对榕母管蓟马成虫的毒力

①榕母管蓟马成虫受供试菌株侵染后的死亡趋势

由图1至图4可知，榕母管蓟马成虫受4株蜡蚧轮枝菌菌株侵染后的死亡趋势均随菌剂浓度升高和侵染时间延长而上升，但不同菌剂中榕母管蓟马成虫累计校正死亡率大小及死亡趋势的变幅则明显不同。Vp28、V3450和V16063菌株，榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率均在接菌3～4d后呈现快速递增，7～8d后趋于平缓；10d后1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1处理的累计校正死亡率，以V3450最高(77.11％～85.54％)，V16063位居其次(75.90％～78.31％)，Vp28位居第3(66.26％～74.70％)。而V07菌株，榕母管蓟马成虫的累计校正死亡率虽在接菌3～4d后也开始递增，但递增速度较缓，6～7d后就趋于平缓，10d后1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^-1处理的累计校正死亡率分别为43.37％和54.22％，仅是其他3株菌株的56.24％～65.45％和63.39％～72.58％。

②供试菌株对榕母管蓟马成虫的LT₅₀

由表2可知，1.00×10⁴mL^-1处理浓度，4株供试菌株的LT₅₀均较长(9.38～13.30d)，其中以V3450菌株最短，其他依次为Vp28、V07和V16063菌株，相互间差异不显著。1.00×10⁵和1.00×10⁶mL^-1处理浓度，4株供试菌株的LT₅₀略有变短(8.50～11.69d和7.23～10.09d)，但仍以V3450菌株最短，其他则依次为Vp28、V16063和V07菌株，且相互间存在差异但不显著。1.00×10⁷和1.00×10⁸mL^﹣1处理，4株供试菌株的LT₅₀均明显变短，但还是以V3450菌株最短(5.72d和5.17d)，V16063菌株位居其次(5.77d和5.54d)，Vp28菌株位居第3(6.38d和5.86d)；V07菌株最长，且与其他3株菌株差异显著。

表2 4株供试菌株对榕母管蓟马成虫的LT₅₀

注：同行不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

③供试菌株生物学特性与毒力相关性的逐步回归分析

由表3可知，在逐步回归分析过程中，蜡蚧轮枝菌4个生物学指标对菌株毒力的作用水平不同。产孢量(x₃)和孢子萌发率(x₄)对累计校正死亡率(y₁)和LT₅₀(y₂)的作用不显著(F＝0.00)，而被剔除；菌株生长速度(x₁)和孢子GT₅₀(x₂)对累计校正死亡率(y₁)和LT₅₀(y₂)的作用则达显著水平(F≥28.34)，被引入后得2个最优回归方程y₁＝－1434.0017+217.9375x₁+75.6041x₂和y₂＝175.8298－23.8111x₁－9.0535x₂，相关系数分别高达0.9993和0.9962，且显著性检验均达显著水平(P＜0.05)。同时，由方程变量的偏相关分析可知，累计校正死亡率与菌株生长速度呈极显著正相关(P＜0.01)，与孢子GT₅₀呈显著正相关(P＜0.05)；LT₅₀与菌株生长速度和孢子GT₅₀均呈显著负相关(P＜0.05)。

表3蜡蚧轮枝菌生物学特性与毒力相关性的逐步回归分析

注：x₁、x₂、x₃和x₄分别表示菌株生长速度、孢子GT₅₀、产孢量和孢子萌发率，y₁和y₂分别表示累计校正死亡率和LT₅₀。

3、结论

4株蜡蚧轮枝菌菌株的生物学特性存在异同，产孢量和孢子萌发率均很高，但V3450菌株生长速度最快、孢子GT₅₀最短，V16063和Vp28菌株生长速度较快、孢子GT₅₀较短，V07菌株生长速度最慢、孢子GT₅₀最长；榕母管蓟马成虫受供试菌株侵染后的死亡趋势均随菌剂浓度升高和侵染时间延长而上升，但不同菌剂中的变幅则明显不同，侵染致死效果次序为V3450＞V16063＞Vp28＞V07，LT50次序为V3450＜V16063＜Vp28＜V07。通过逐步回归分析探讨菌株生物学特性与毒力的相关性发现，菌株毒力与其生长速度和孢子GT₅₀显著相关，菌株生长越快、孢子萌发越快，毒力越高；而菌株毒力与产孢量和孢子萌发率未呈显著相关，这可能是由于供试菌株的产孢量和孢子萌发率均很高且差异不显著的缘故。可见，在供试菌株产孢量和孢子萌发率均很高且相互间差异不显著时，菌株生长速度和孢子GT₅₀可作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的初筛指标，所构建的2个最优回归方程可用于榕母管蓟马防治高效蜡蚧轮枝菌菌株的快速初筛；而对于低产孢量和低孢子萌发率的菌株，无需经过方程评判，可直接淘汰。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。