本发明涉及一种可降解生物医用高分子材料的生产技术领域，具体涉及一种含胺基碱性基团和生物信号分子的高分子量聚丙乙交酯改性聚合物（RGD-EMPLGA）的制备方法。
背景技术：
由于机械损伤或关节炎造成的软骨缺损是医学上长期难以克服的问题。成年软骨修复能力有限，软骨缺损直径小于3mm能自发修复，但当直径大于3mm时，缺损部位无法自行修复。组织工程学技术为骨缺损的修复提供了新的方法，它具有对供体损伤小、无抗原性、可制成三维立体、解剖结构精确等优点，因而具有广阔的应用前景。
应用于软骨组织修复的合成可降解高分子主要有聚乳酸（PLA）、聚丙乙交酯（PLGA）等。其中PLGA由于具有一定的机械强度和易调控的降解速率，容易宏观塑形等优点，广泛应用于组织工程和药物缓释等领域，但其低的亲水性、活性基团和生物信号分子的缺乏以及体内酸性降解产物的累积等缺陷导致其应用受到限制。
采用共聚改性、接枝、表面可控胺解等方法引入功能活性基团或生物信号分子，是改善聚乳酸及其共聚物性能的重要方法。马来酸酐是一种可在生物体内正常代谢的多官能团物质，其酸酐中的碳-碳双键可发生自由基反应。罗彦凤教授课题组采用马来酸酐和乙二胺接枝聚乳酸，改善了聚乳酸的亲水性能。Wang等采用接枝法将马来酸酐、脂肪二胺和粘附性RGD肽引入聚乳酸链制备了具有生物活性聚合物，有效降低了其降解过程酸性物质的积累。目前采用马来酸酐的改性主要是对聚乳酸的接枝改性，而对PLGA接枝鲜见报导。本课题组采用D,L-丙交酯、乙交酯和马来酸酐通过直接熔融聚合获得了马来酸酐接枝聚丙乙交酯（MPLGA），已成功申请专利（见ZL2013.10564511.1），该方法操作简单，获得的共聚物中具有较高的酸酐接枝率（2.0~10.0%）。但是由于共聚过程中共聚物的分子量受单体和马来酸酐的纯度影响很大，且参与反应的物质越多，其分子量的影响因素越复杂，实验重现性越差。同时采用直接熔融共聚获得的MPLGA分子量较小（＜1.0 × 105Da），无法满足不同医用材料的需求，限制了其在生物医用材料临床的应用。另外，MPLGA中的酸酐键使其在体内降解过程中会导致酸性降解物积累，MPLGA中生物信号分子的缺乏使得细胞在其支架材料内易去分化而失去生物学功能。
脂肪族二胺是一种强碱性胺，可以同酸酐类物质发生 N-酰化反应。利用MPLGA材料中的酸酐键可以将脂肪族二胺引入到高分子骨架中，可望在进一步提高材料亲水性能的同时有效缓解材料在降解过程中酸性物质积累的问题。
粘附性RGD多肽由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合，能有效地促进细胞在生物材料表面的粘附。同时还介导跨膜信号的传递，可启动胞内外信号的传递，触发细胞的增殖、迁移、分化、分泌等功能活动，使种子细胞能获得良好的生物学特性，在组织工程研究领域具有广阔的应用前景。
本发明采用D,L-丙交酯、乙交酯熔融共聚获得高分子量的PLGA，再以马来酸酐直接接枝到PLGA骨架中，接枝过程中PLGA分子量下降程度小，可获得高分子量MPLGA。再依次引入乙二胺和RGD多肽功能分子，获得兼具乙二胺碱性功能基团和生物信号分子的高分子量RGD-EMPLGA生物医用材料，可望应用于不同医用材料领域。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种兼具乙二胺碱性功能基团和生物信号分子的高分子量RGD-EMPLGA聚合物的制备方法。
本发明提供的乙二胺和RGD改性高分子量PLGA制备RGD-EMPLGA的技术路线见附图1。
本发明方法的步骤如下：
（1）将D,L-丙交酯、乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入一定量辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥12~24 h后，在常温下采用扩散泵抽高真空0.5~1.0 h，使安瓿瓶内压强低于5.0Pa，封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在120~170℃温度下反应12~60 h后取出。将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，然后滴入3~5倍体积的乙醇中沉析，反复沉析3-5次，将提纯后的产物真空干燥至恒重即得PLGA聚合物。
（2）将纯化后的PLGA与一定量的马来酸酐、过氧化二苯甲酰（BPO）混合，置于减压、100℃的环境中反应24h即得到MPLGA粗聚物。将粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，每小时回流4~6次以除去均聚物，将抽提后的共聚物40℃下真空干燥至恒重。将共聚物加入到三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析，反复沉析3~5次，然后将提纯物40℃下真空干燥至恒重，得到纯MPLGA。
（3）将纯化后的MPLGA溶于三氯甲烷中，配制成20~30wt%的MPLGA的三氯甲烷溶液。
（4）将乙二胺溶于三氯甲烷中，配制成浓度为30~40wt%的乙二胺的三氯甲烷溶液。
（5）在搅拌的条件下，将步骤（4）所得乙二胺的三氯甲烷溶液滴入到步骤（3）所得MPLGA的三氯甲烷溶液中，冰浴控制反应体系温度低于10℃，保温5~10min，再将温度升至室温反应30~60min，最后将产物滴入过量的乙醇中沉析，反复沉析3~5次，用去离子水洗涤至中性，真空干燥至恒重，得到乙二胺改性马来酸酐化聚丙乙交酯聚合物（EMPLGA）固体。
（6）将EMPLGA溶于四氢呋喃中，配制成10wt%的溶液，加入一定量的偶联剂N,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将一定量的RGD溶解于50mL四氢呋喃中，在搅拌条件滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到乙二胺和RGD多肽改性高分子量聚丙乙交酯聚合物。
步骤（1）中，所述D,L-丙交酯、乙交酯、辛酸亚锡的重量配比为：D,L-丙交酯70~80份、乙交酯20~30份、辛酸亚锡0.01~0.03份，且辛酸亚锡经脱水处理。
步骤（1）中，所述三氯甲烷溶液（1~5wt%）的浓度直接与PLGA分子量大小有关，分子量越大，配制的三氯甲烷溶液浓度应越小。
步骤（2）中，所述马来酸酐的量为D,L-丙交酯、乙交酯单体总量的5~10 wt%，过氧化苯甲酰的加入量为马来酸酐重量的1~5 wt%。所述的减压环境为压力低于0.090MPa。
步骤（5）中，所述乙二胺的加入量为MPLGA质量的20~30%。
步骤（6）中，所述N,N’-二环乙基碳二亚胺的加入量为EMPLGA的10~20wt%，RGD多肽的加入量为EMPLGA的0.1wt%。
本发明中RGD-EMPLGA的制备是利用高分子骨架中的酸酐键N-酰化反应，将乙二胺和RGD依次共价接入到高分子材料中。制备过程中需严格控制乙二胺溶液和RGD溶液的滴加速度和反应体系温度，防止体系温度过高。本发明提纯后产物为淡黄色固体，具有一定脆性，分子量可达1.0~2.0×105Da以上。
本发明成功设计出了乙二胺和RGD改性高分子量PLGA的制备方法，为获得细胞亲和性和可控降解的RGD-EMPLGA提供了详细的说明。
本发明所得到的RGD-EMPLGA具有以下优点：
（1）采用直接熔融共聚制备的PLGA分子量可达1.0~2.0 × 105Da，共价引入马来酸酐和乙二胺，获得了含马来酸酐和胺基活性基团的高分子量EMPLGA，拓展其降解性能的调控范围，同时能有效缓解材料在降解过程中酸性物质积累现象。
（2）共价引入RGD多肽等生物信号分子，获得了高分子量的RGD-EMPLGA材料，能有效改善材料的细胞亲和性，对细胞的粘附、增殖、生长具有显著的促进作用。
（3）马来酸酐、乙二胺和RGD共价引入PLGA骨架过程中，PLGA分子量下降较少，制备的高分子量RGD-EMPLGA材料可满足不同生物医用领域。
附图说明
图1乙二胺和RGD改性高分子量PLGA制备RGD-EMPLGA的技术路线。
具体实施方式
下面通过具体实施例来对本发明作进一步详细的描述，所述的原料份数除特别说明外，均为重量份数。
实施例1：
将80g干燥后的D,L-丙交酯、20g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入0.01g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在4.0Pa的条件下用酒精喷灯封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在130℃温度下反应36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗产物PLGA。所得产品Mw=1.82×105Da，Mw/Mn=1.25。
将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3~5次，真空干燥。将纯化后的PLGA与6g马来酸酐、0.15g过氧化二苯甲酰混合，置于三颈烧瓶中，在压强为0.081MPa、100℃的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。将接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3-5次，然后将提纯物真空干燥至恒重，得到淡黄色纯接枝共聚物MPLGA。所得产品Mw=1.73×105Da，Mw/Mn=1.28，接枝率为1.15%。
将10g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制25wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等体积的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。将MPLGA的三氯甲烷加入装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制体系温度低于10℃。滴加完毕，保温5min后，再将温度升至室温反应60 min。将产物滴入过量的乙醇溶液中沉淀析出，用去离子水洗涤呈中性，产物40℃真空干燥至恒重，得到黄色的EMPLGA固体。
取2gEMPLGA溶于20mL四氢呋喃中，加入0.35gN,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将2mgRGD溶解于50mL四氢呋喃中，搅拌，滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到淡黄色的RGD-EMPLGA固体。
实施例2：
将70g干燥后的D,L-丙交酯、30g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入0.02g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥24 h后，在3.0Pa的条件下用酒精喷灯封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在140℃温度下反应48 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗产物PLGA。所得产品Mw=1.91×105Da，Mw/Mn=1.21。
将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3~5次，真空干燥。将纯化后的PLGA与7g马来酸酐、0.2g过氧化二苯甲酰混合，置于三颈烧瓶中，在压强为0.081MPa、100℃的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。将接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3-5次，然后将提纯物真空干燥至恒重，得到淡黄色纯接枝共聚物MPLGA。所得产品Mw=1.86×105Da，Mw/Mn=1.21，接枝率为1.42%。
将10g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制25wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等体积的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。将MPLGA的三氯甲烷加入装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制体系温度低于10℃。滴加完毕，保温5min后，再将温度升至室温反应60 min。将产物滴入过量的乙醇溶液中沉淀析出，用去离子水洗涤呈中性，产物40℃真空干燥至恒重，得到黄色的EMPLGA固体。
取1g纯化后的EMPLGA溶于10mL四氢呋喃中，加入0.1gN,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将1.5mgRGD溶解于50mL四氢呋喃中，搅拌，滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到淡黄色的RGD-EMPLGA固体。
实施例3：
将75g干燥后的D,L-丙交酯、30g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入0.02g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥12 h后，在5.0Pa的条件下用酒精喷灯封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在150℃温度下反应24 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗产物PLGA。所得产品Mw=1.65×105Da，Mw/Mn=1.32。
将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3~5次，真空干燥。将纯化后的PLGA与6.0g马来酸酐、0.2g过氧化二苯甲酰混合，置于三颈烧瓶中，在压强为0.081MPa、100℃的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。将接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3-5次，然后将提纯物真空干燥至恒重，得到淡黄色纯接枝共聚物MPLGA。所得产品Mw=1.52×105Da，Mw/Mn=1.36，接枝率为0.95%。
将10g MPLGA溶于27mL三氯甲烷中配制20wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等体积的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。将MPLGA的三氯甲烷加入装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制体系温度低于10℃。滴加完毕，保温5min后，再将温度升至室温反应60 min。将产物滴入过量的乙醇溶液中沉淀析出，用去离子水洗涤呈中性，产物40℃真空干燥至恒重，得到黄色的EMPLGA固体。
取1.5gEMPLGA溶于15mL四氢呋喃中，加入0.25gN,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将1.5mgRGD溶解于50mL四氢呋喃中，搅拌，滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到淡黄色的RGD-EMPLGA固体。
实施例4：
将72g干燥后的D,L-丙交酯、28g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入0.01g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥24 h后，在2.0Pa的条件下用酒精喷灯封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在160℃温度下反应12 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗产物PLGA。所得产品Mw=1.21×105Da，Mw/Mn=1.43。
将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3~5次，真空干燥。将纯化后的PLGA与5.0g马来酸酐、0.3g过氧化二苯甲酰混合，置于三颈烧瓶中，在压强为0.081MPa、100℃的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。将接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3-5次，然后将提纯物真空干燥至恒重，得到淡黄色纯接枝共聚物MPLGA。所得产品Mw=1.12×105Da，Mw/Mn=1.47，接枝率为1.16%。
将10g MPLGA溶于16mL三氯甲烷中配制30wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等体积的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。将MPLGA的三氯甲烷加入装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制体系温度低于10℃。滴加完毕，保温5min后，再将温度升至室温反应60 min。将产物滴入过量的乙醇溶液中沉淀析出，用去离子水洗涤呈中性，产物40℃真空干燥至恒重，得到黄色的EMPLGA固体。
取0.5gEMPLGA溶于5mL四氢呋喃中，加入0.15gN,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将0.5mgRGD溶解于50mL四氢呋喃中，搅拌，滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到淡黄色的RGD-EMPLGA固体。
实施例5：
将75g干燥后的D,L-丙交酯、20g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中，再加入0.03g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)；真空干燥24 h后，在2.0Pa的条件下用酒精喷灯封管。将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中，在140℃温度下反应36 h，敲碎安瓿瓶，取出得粗产物PLGA。所得产品Mw=1.89×105Da，Mw/Mn=1.15。
将粗产物溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3~5次，真空干燥。将纯化后的PLGA与8.0g马来酸酐、0.25g过氧化二苯甲酰混合，置于三颈烧瓶中，在压强为0.081MPa、100℃的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。将接枝后的粗聚物置于Soxhelt抽提器内，以三氯甲烷为溶剂抽提8 h，将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中，配制成1~5wt%溶液，滴入3~5倍体积的乙醇中沉析3-5次，然后将提纯物真空干燥至恒重，得到淡黄色纯接枝共聚物MPLGA。所得产品Mw=1.81×105Da，Mw/Mn=1.19，接枝率为1.68%。
将10g纯化后MPLGA溶于16mL三氯甲烷中配制30wt% MPLGA的三氯甲烷溶液，等体积的乙二胺和三氯甲烷混合配制38wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。将MPLGA的三氯甲烷加入装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，在搅拌的条件下滴加1mL乙二胺的三氯甲烷溶液，冰浴控制体系温度低于10℃。滴加完毕，保温5min后，再将温度升至室温反应60 min。将产物滴入过量的乙醇溶液中沉淀析出，用去离子水洗涤呈中性，产物40℃真空干燥至恒重，得到黄色的EMPLGA固体。
取1gEMPLGA溶于10mL四氢呋喃中，加入0.2gN,N’-二环乙基碳二亚胺，采用N-甲基吗啡啉调节溶液pH值至8~9。将1mgRGD溶解于50mL四氢呋喃中，搅拌，滴入EMPLGA的四氢呋喃溶液中，冰浴控制反应体系温度在0℃左右，反应24小时后过滤，用过量的去离子水沉淀，将产物冷冻干燥，得到淡黄色的RGD-EMPLGA固体。