本发明涉及一株同时降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌，属于微生物技术领域。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一种2A类致癌物，被认为是食品中继黄曲霉毒素之后的又一重要污染物。很多研究者在许多酒饮料和食品中检测到了氨基甲酸乙酯的存在。自此，发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量受到广泛关注。已有报道检测了不同香型成品白酒中EC的含量，结果显示白酒中EC平均含量约为100μg·L-1，低于150μg·L-1的国际限量标准。其中，清香型、酱香型、药香型及特香型白酒中EC含量较低，而浓香型、芝麻香型、凤香型等白酒中EC含量偏高。
在烘焙和发酵食品中，经常在发酵液中添加尿素作为酵母的氮源。已有报道显示尿素与乙醇反应可以生成EC；同时发现葡萄汁发酵过程中EC的主要来源是由精氨酸分解而来的尿素。日本研究者通过基因工程手段构建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，利用该酵母发酵发现没有尿素的累积，并且EC含量大幅度下降。范文来、徐岩等也发现酒醅中尿素和EC的变化趋势类似，二者之间具有一定的相互关系。酒饮料中的EC可能产生于蒸馏前、蒸馏时及蒸馏后各个阶段，目前，普遍认为蒸馏前，也就是发酵阶段形成的EC主要来源于尿素。
因此，获取能降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌，对于以粟酒裂殖酵母作为主要功能微生物的发酵食品的生产就显得尤为重要，对于食品安全具有重要贡献。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一株降解精氨酸和尿素的粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)。
所述粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)，已于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12715，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715是从白酒酒醅中筛选得到的。
所述粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715具有如下特性：
(1)本发明的粟酒裂殖酵母菌对高粱汁中的精氨酸的降解能力达1.01mmol·L-1且只生成较少的尿素(0.54mmol·L-1)；
(2)本发明的粟酒裂殖酵母菌对，对高粱汁中的尿素的降解能力高达2.03mmol·L-1；
(3)产多种风味物质；
(4)用于酒精饮料发酵过程中，通过在发酵过程中适当提高其含量，可以有效降低精氨酸和尿素含量，有利于发酵过程中EC含量的降低。
本发明的第二个目的是提供含有所述CGMCC NO.12715菌株的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有CGMCC NO.12715菌体的活细胞、冷冻干燥得到的CGMCC NO.12715干菌体、固定化的CGMCC NO.12715细胞、CGMCC NO.12715的液体菌剂、CGMCC NO.12715的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.12715菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有保藏编号为CGMCC NO.12717的植物乳杆菌和保藏编号为CGMCC NO.12716的发酵乳杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂是将保藏编号为CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏编号为CGMCC NO.12716的发酵乳杆菌、保藏编号为CGMCC NO.12717的植物乳杆菌分别活化后，按照体积比1:1:1混合得到液体菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。
本发明的第三个目的是提供所述微生物菌剂在食品技术领域的应用，尤其是应用于发酵食品技术领域。
本发明的第四个目的是提供所述CGMCC NO.12715菌株或者所述含有CGMCC NO.12715的微生物菌剂的应用，是应用于食品技术领域，尤其是发酵食品技术领域。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将所述CGMCC NO.12715菌株或者所述含有CGMCC NO.12715的微生物菌剂添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。
本发明的第五个目的是提供一种酒精饮品的制备方法，所述方法是在酒精饮料的发酵过程中额外接种含有保藏编号为CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵菌的微生物菌剂到发酵基质中。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂以粟酒裂殖酵菌为唯一微生物；所述方法是在白酒发酵酒醅中额外接种CGMCC NO.12715菌株至107CFU/g酒醅。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂是将保藏编号为CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏编号为CGMCC NO.12716的发酵乳杆菌、保藏编号为CGMCC NO.12717的植物乳杆菌分别活化后，按照体积比1:1:1混合得到液体混合菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是在白酒发酵酒醅中额外接种微生物菌剂至微生物菌剂含量为107CFU/g酒醅。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是微生物制剂按照总接种量107CFU/g酒醅接种至固态发酵培养基中，并接种10wt％的大曲，放置30℃恒温培养箱中静置发酵6d。
其中，固态发酵培养基的制备：称250g高粱，加入350mL蒸馏水，于70-80℃培养箱中浸泡24h。将水沥干，称取500g高粱于真空袋中，再加入25mL蒸馏水；121℃，灭菌20min；加酶糖化1d。
本发明的有益效果：
本发明的粟酒裂殖酵母菌，是目前能同时降解精氨酸和尿素且降解效果最好的粟酒裂殖酵母菌。本发明的CGMCC NO.12715对高粱汁中的精氨酸的降解能力达1.01mmol·L-1且只生成较少的尿素(0.54mmol·L-1)；对高粱汁中的尿素的降解能力高达2.03mmol·L-1；产多种风味物质；用于酒精饮料发酵过程中，通过在发酵过程中适当提高其含量，可以有效降低精氨酸和尿素含量，有利于发酵过程中EC含量的降低。
生物材料保藏
本发明所提供的粟酒裂殖酵母菌，分类学命名为粟酒裂殖酵母菌Schizosaccharomyces pombe，已于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12715，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的发酵乳杆菌，分类学命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，已于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12716，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的植物乳杆菌，分类学命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，已于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12717，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
EC含量测定参照文献：顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用定量蒸馏酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工业科技,2012,33(14):60-63。
酒醅中尿素含量的测定
尿素含量测定参照文献：Jimenez-Martin E,Ruiz J,Perez-Palacios T,et aL.Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of free amino acids as their dimethyl-tert-butylsilyl(TBDMS)derivatives in animal source food[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(10):2456-2463。
实施例1：本发明的粟酒裂殖酵母对精氨酸、尿素的降解情况
酵母是将精氨酸转化为尿素的主要菌群，由于生长需求，酵母需大量的氮源。环境中的精氨酸和尿素都可作为氮源供酵母吸收利用，但酵母优先利用精氨酸。因此，环境中精氨酸、尿素和酵母菌等都会影响发酵过程中尿素的含量，从而影响EC的含量。而酵母的数量和代谢能力是影响尿素水平的重要因素，研究发酵体系中酵母将精氨酸代谢成尿素的能力很有必要。
根据酒醅中精氨酸和尿素检测结果设计代谢实验中精氨酸添加量为300mg L-1(高粱汁培养基中本身含有一定的精氨酸，额外添加300mg L-1后总精氨酸含量约690mg/L，接近真实酒醅中精氨酸含量)，尿素添加量为200mg L-1。发酵采用高粱汁对实验菌株进行精氨酸、尿素的代谢实验。
实验及对照组设定：
空白1：高粱汁培养基按2％接种量接种，不添加精氨酸及尿素；
实验组1：添加300mg L-1精氨酸的高粱汁培养基按2％接种量接种；
实验组2：添加200mg L-1尿素的高粱汁培养基按2％接种量接种；
其中，实验菌株是按2％接种量接种到培养基中，30℃下静置培养48～54h。测定发酵起点、发酵终点的发酵液中精氨酸、尿素的含量以及活菌数。
高粱汁培养基：将高粱:水＝1:4(M:V)，加淀粉酶蒸煮液化，60℃加糖化酶糖化，过滤离心，调节糖度至10°Bx。
选取发酵酒醅中筛出的4株对精氨酸和/或尿素代谢能力相对较强的酵母Saccharomyces cerevisiae C3、Zygosaccharomyces bailii C7、Schizosaccharomycespombe C11和Issatchenkia orientalis C16进行精氨酸和尿素的代谢能力实验。
结果如表1所示。从表1中可以看出4株酵母菌都可以降解精氨酸生成尿素，但其能力有强有弱。S.cerevisiae C-3降解精氨酸生成尿素的能力虽然很强，但是对尿素的降解能力较弱，只有0.56mmol·L-1。S.pombe C-11对精氨酸的降解能力达1.01mmol·L-1且只生成较少的尿素(0.54mmol·L-1)，对尿素的降解能力高达2.03mmol·L-1，是4株酵母中最强的。针对这一特点，若在发酵过程中适当提高其含量，可以有利于发酵过程中EC含量的降低。
表1 4株酵母菌对精氨酸和尿素的代谢能力
粟酒裂殖酵母菌Schizosaccharomycespombe C11，已于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12715。
此外，本发明还得到的能同时高效降解精氨酸和尿素的发酵乳杆菌CGMCC NO.12716(L. fermentum JSA30)、植物乳杆菌CGMCC NO.12717(L.plantarum JD19)，如表2所示。同时，植物乳杆菌CGMCC NO.12717和发酵乳杆菌CGMCC NO.12716，都能够代谢产生酸类、醇类、酮类、酚类等物质，为白酒提供重要的风味化合物；CGMCC NO.12717和CGMCC NO.12716，于MRS培养基、30℃厌氧发酵2d后进入稳定期，菌体浓度分别可达OD600＝3.5、OD600＝2.4，发酵液pH分别为3.8、4.3；发酵36h后乳酸含量分别可达到24g/L、12g/L；发酵3d的乙酸产量分别可达5.7g/L、6g/L。
表2CGMCC NO.12716和CGMCC NO.12717对精氨酸和尿素的代谢情况
实施例2：粟酒裂殖酵母产风味物质测定
高粱浸出汁培养基：高粱200g→粉碎→加水800mL和高温淀粉酶200μL→蒸煮20min→加入高温淀粉酶200μL，蒸煮20min→冷却后加入液化酶1mL→55℃保温4h→过滤得滤液。
将粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715菌株种子液摇瓶培养1d后，按107CFU/mL接种量接入高粱浸出汁培养基于30℃培养箱中恒温静置培养6d。并检测发酵结束时发酵液的风味物质。
运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法分析。分别取8mL离心后的上清液和蒸馏液，放入装有3g钠盐的顶空进样瓶中。以4-甲基-2-戊醇为内标。旋紧瓶盖，将顶空瓶置于50℃恒温萃取45min。萃取完后进GC-MS分析，GC-MS分析条件见文献。结果如表3所示。
表3主要风味物质
实施例3：CGMCC NO.12715的固态模拟发酵
固态发酵培养基的制备：称250g高粱，加入350mL蒸馏水，于70-80℃培养箱中浸泡24h。将水沥干，称取500g高粱于真空袋中，再加入25mL蒸馏水。121℃，灭菌20min。加酶糖化1d。
对照组：在额外有添加300mg L-1的精氨酸的固态发酵培养基中接种10wt％的大曲，30℃ 恒温培养箱中静置发酵6d。
实验组1：将粟酒裂殖酵母菌CGMCC NO.12715的种子液以终浓度107CFU/g酒醅的接种量接种至额外有添加300mg L-1的精氨酸的固态发酵培养基中，并接种10wt％的大曲，放置30℃恒温培养箱中静置发酵6d。
实验组2：将保藏编号为CGMCC NO.12715的粟酒裂殖酵母、保藏编号为CGMCC NO.12716的发酵乳杆菌、保藏编号为CGMCC NO.12717的植物乳杆菌分别活化后，按照体积比1:1:1混合得到液体混合菌剂。测定液体混合菌剂中的细胞浓度，然后以107CFU/g酒醅的接种量接种至额外有添加300mg L-1的精氨酸的固态发酵培养基中，并接种10wt％的大曲，放置30℃恒温培养箱中静置发酵6d。
实验组3：与实验组1相比，仅仅是将额外添加的300mg L-1精氨酸替换成额外添加200mg L-1尿素。
实验组4：与实验组2相比，仅仅是将额外添加的300mg L-1精氨酸替换成额外添加200mg L-1尿素。
实验组和对照组各3个平行，结果取平均值，如表4-5所示。由表4可知，通过接种CGMCC NO.12715或者本发明的混合微生物菌剂强化发酵，可以有效降解精氨酸和尿素。同时，实验组得到的产品风味更佳优良，尤其是实验组2。
表4发酵结果
其中，Cit为瓜氨酸、Arg为精氨酸，Orn为鸟氨酸。Δ代表发酵后相应物质的含量-发酵前的含量，比如ΔCit代表发酵6d后发酵物中瓜氨酸含量减去初始培养基中的瓜氨酸含量。
表5发酵结果
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。