一株缺乏ED代谢途径的普通生酮基古龙酸菌及其生产2－KGA的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，涉及一株生产2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA)的菌株及其生产方法，具体涉及利用微生物发酵的手段将底物L-山梨糖转化为2-KGA的菌株及工艺。

背景技术：
：

VC是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔，市场规模巨大。

目前，全球90％以上的VC生产，均利用我国发明的“二步发酵法”。其第一步发酵是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。最后经过化学转化使2-KGA生成VC。

第二步发酵生产2-KGA是决定VC发酵产率和成本的关键步骤。在其混合菌系中：酮古龙酸菌是产2-KGA的关键菌株，具有氧化底物L-山梨糖为2-KGA的酶系统。但该菌独立生长及产2-KGA能力非常弱，需要巨大芽孢杆菌提供某些“效应物”促进其生长及产2-KGA。该菌本身能独立生长，却不能转化L-山梨糖为2-KGA。

由于L-山梨糖在转化为2-KGA的过程中，其中间产物L-山梨酮可在山梨酮脱氢酶(SNDH)的作用下，伴随副产物维生素C的产生；同时L-山梨糖亦作为酮古龙酸菌自身碳源参与糖代谢作用，故在实际发酵过程中，2-KGA的转化率通常在90％左右，难以进一步提升。在本发明中，由于SPUB 805具有良好的生长状态，并且缺乏酮古龙酸菌体内的一条重要糖代谢途径(ED pathway)，同时亦缺乏伴随副产物VC产生的SNDH，故在产2-KGA发酵的过程中，该菌具有较高的产物转化率及较短的发酵周期。

现有技术中，未见具有上述性状特征的天然酮古龙酸菌及基因工程菌株的报道。

技术实现要素：
：

本发明要解决的一个技术问题是提供一株可高产2-KGA的微生物菌株普通生酮基 古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)，减少VC二步发酵过程中，底物L-山梨糖参与糖代谢及产生其它副产物的数量，进而提高目标产物2-KGA的转化率。

本发明的技术方案如下：

经过实验室分离、筛选及进一步人工驯化得到了一株性状稳定，并具有较高2-KGA转化率的菌株SPU B805，连续40次传代证明该菌性状稳定。

本发明所述的普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)为革兰氏阴性菌，短杆，可形成短链或丝状体，不能形成芽孢(见图1)；在原有酮古龙酸菌固体培养基培养4天的菌落形态为点状，凸起，完整，光滑的圆形菌落，菌落表面成油状，透明，有棕色色素产生。基于16SrDNA测序及生理生化指标考察，经鉴定该菌为普通生酮基古龙糖酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(见图2)。

进一步利用454-焦磷酸测序技术，构建并完成了该菌株的全基因组完成图。并进一步完成了该菌株的基因组注释及与已知酮古龙酸菌(Y25及WSH-001)基因组的比较基因组学研究。比较基因组分析表明，SPU B805与已知菌株Y25及WSH-001最大的区别为缺少两菌体内分别存在的大质粒pYP2及pKVU_200，同时SPU B805基因组与其它两株菌相比亦存在部分基因片段的重排(见图3)，除此各功能基因几乎相同。由于SPU B805质粒的缺失，导致了该菌体内缺乏酮古龙酸菌ED途径三种关键酶(包括：2-dehydro-3-deoxygluconokinase，EC:2.7.1.45；phosphogluconate dehydratase，EC:4.2.1.12及2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase，EC:4.1.2.14)及一种利用L-山梨酮直接产生维生素C的关键酶L-sorbosone dehydrogenase，EC:1.1.5.2，见表1。

表1.与已知Ketogulonicigenium vulgare Y25及WSH-001比较，SPU B805体内缺乏的关键酶及其对应的酶促反应

本发明要解决的另一个技术问题是提供菌株酮古龙酸菌SPU B805发酵生产2-KGA 的方法，发酵方法如下：

1.分离及斜面培养基：酵母膏0.1-10g/L、牛肉膏0.1-10g/L、玉米浆0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、无水硫酸镁0.1-10g/L、山梨糖0.2-20g/L、碳酸钙0.1-10g/L、琼脂20g/L、pH5.0-8.0。

2.种子培养基：L-山梨糖0.5-40g/L、玉米浆0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、酵母膏0.1-5g/L、葡萄糖0.1-50g/L、D-山梨醇0.2-20g/L、D-甘露醇0.1-20g/L、碳酸钙0.1-10g/L、pH5.0-8.0。

3.发酵培养基：L-山梨糖10-150g/L、玉米浆0.1-20g/L、尿素1-40g/L、无水硫酸镁0.1-0.5g/L、pH5.0-8.0；

4.培养方法：

(1)斜面培养

挑取SPU B805菌体与伴生菌Bacillus megaterium于斜面培养基搭配26-34℃混合培养3-5天。

(2)种子培养

将SPU B805与伴生菌Bacillus megaterium混合培养的斜面接入15～30mL的种子培养基的250mL三角瓶中16-32h，于26～34℃震荡培养，转速为150-300rpm，制备发酵用种子液。

(3)摇瓶发酵培养

将培养好的种子液按接种量5-25％(v/v)接种于装有20～40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于26～34℃震荡培养，转速为150-300rpm，培养32-44h。

(4)发酵罐培养

发酵培养基培养10-12h后采用连续流加L-山梨糖工艺，控制底物L-山梨糖浓度，L-山梨糖底物初始度为1-5％，终点累积流加量控制在8-12％，优选8-10％，流加时间控制在12-36h，使用20-25％的碳酸钠控制pH为6.5-8.0。

(5)本发明提供了该菌株在发酵过程中，产生2-KGA的最佳温度为30-32℃，摇瓶发酵L-山梨糖最佳终点浓度为8％；发酵罐培养最佳底物L-山梨糖浓度为4％，最佳L-山梨糖流加总量为6-10％。

本发明的有益效果：与原VC二步发酵生产菌株相比较，在底物L-山梨糖为8％的浓度下，经过32-44h摇瓶发酵，2-KGA的转化率为90％以上(对照组为85％)，在底物L-山梨糖为8-10％的浓度下，5L发酵罐36-48h发酵，2-KGA的转化率可达到95％以上 (对照组约为90％)。

本发明使用的普通生酮基古龙糖酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)(SPU B805)已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏日期2016年8月17日，保藏编号为CGMCC No.12858。

附图说明：

图1为与Bacillus megaterium混合培养的Ketogulonicigenium vulgare SPU B805光镜1000倍下的形态。

图2为Ketogulonicigenium vulgare SPU B805与临近种属菌株的系统发育关系。

图3.Ketogulonicigenium vulgare SPU B805与已知酮古龙酸菌基因组比较。图中相同图案框图代表同源序列，其中菌株WSH-001及Y25分别拥有2个大质粒pKVU_100，pKVU_200及pYP1，pYP2。在K.vulgare SPU B805基因组中，存在与pKVU_100及pYP1相同的同源序列(灰色框)，而质粒pKVU_200及pYP2(白色框)在SPU B805中缺失。

具体实施方式：

实施实例1：酮古龙酸菌SPU B805体内所缺乏的4种关键酶及其基因序列见SEQ ID：1，SEQ ID：2，SEQ ID：3，SEQ ID:4。

实施实例2：酮古龙酸菌SPU B805生物学特性

SPU B805在革兰氏染色后，呈革兰阴性菌短杆菌，可形成短链或丝状体，不能形成芽孢。该菌在斜面培养基上生长4天，其菌落形态为点状，凸起，完整，光滑的圆形菌落，菌落表面成油状，透明，有棕色色素产生。

提取菌株SPU B805的基因组DNA，以Primer(S)：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’；和Primer(A)：5’AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’为引物进行PCR扩增16s rRNA基因，纯化后进行基因测序，并将所测序列与Genbank中的rRNA同源序列比对，选取7株较高同源性的菌株，利用软件Mega5构建菌种进化树。菌株SPU B805与Ketogulonicigenium vulgare同源性最高。再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为Ketogulonicigenium vulgare。

实施实例3：菌株SPU B805摇瓶发酵特性

将混菌斜面(SPU B805及Bacillus megaterium)接于种子培养基中，30℃、220rpm摇瓶培养18h后，以15％转种量接种于发酵培养基中，其发酵培养基内含有8％的山梨 糖，于26～34℃，220r/min振荡培养至44h。每隔4h取样，测定2-KGA产量以及转化率，获得实验结果见表2。由此可见，菌株SPU B805在32℃发酵36h可完成发酵，2-KGA平均转化率可到达95.34％。

表2.菌株SPU B805摇瓶发酵特性.

实施实例4：菌株SPU B805发酵的最适底物L-山梨糖浓度的确定

将混菌斜面(SPU B805及Bacillus megaterium)接于种子培养基中，32℃、220rpm摇瓶培养18h后，以10％转种量接种于发酵培养基中，其发酵培养基内含有6％～12％的山梨糖，于32℃，220r/min振荡培养至48h。发酵结束后测定2-KGA的产量和转化率，如表3所示，可见菌株SPU B805最适的山梨糖底物浓度为8％，此条件下转化率平均可达94.72％。

表3.菌株SPU B805发酵的最适底物L-山梨糖浓度的确定

实施实例5菌株SPU B805发酵罐上发酵特性

根据摇瓶发酵研究结果利用发酵培养基，在5L全自动发罐上设计工艺控制参数(如表4)，在不同底物浓度下，对菌株SPU B805发酵性能进行研究，结果见表5。可见菌株SPU B805在36h时其转化率为95.35％。

表4.发酵罐参数设定.

表5.菌株SPU B805在发酵罐上的发酵特性.