一株高产苯乳酸的葡糖醋杆菌及其苯乳酸的制备方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，并涉及一株高产天然食品防腐剂苯乳酸的葡糖醋杆菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97及其苯乳酸的制备方法。

背景技术：

食品防腐剂是指能防止由微生物引起的食物腐败变质，并延长食品保质期的食品添加剂。按生产方式其可被分为合成和天然的两大类，其中合成食品防腐剂成本低、防腐效果好，但其安全性存在争议，随着人们生活水平的提高以及对食品安全性要求的提高，安全性较高的天然食品防腐剂的研发已成为研究热点。而微生物来源的天然防腐剂则是天然食品防腐剂的重要来源。目前已广泛应用于食品工业的微生物来源的天然防腐剂主要包括乳酸链球菌素、纳他霉素、ε - 聚赖氨酸和溶菌酶等，但这些防腐剂都存在抑菌谱窄、理化性质差等缺点，如乳酸链球菌只能抑制革兰氏阳性细菌，纳他霉素只对霉菌有抑制作用，ε - 聚赖氨酸和溶菌酶在偏碱性条件下易失活。

苯乳酸又名2-羟基-3-苯基丙酸，最早是由Dieulevenx等人于1998年从白地霉的代谢产物中分离得到的一种小分子防腐剂。具有亲水性高，对酸、碱、热稳定性好，安全性高，抑菌谱宽等优点。研究表明其对多种食源性致病菌，如单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157，以及黄曲霉、娄地青霉、赭曲霉等腐败真菌都有较好的抑制作用。

目前苯乳酸的制备方法包括化学合成和生物转化两种。其中化学方法存在技术路线复杂，环境污染大，副产物多，不易分离纯化等缺点。故采用微生物发酵法生产苯乳酸一直是人们努力的方向。研究表明，白地霉、乳酸菌、丙酸菌都能转化苯丙氨酸和苯丙酮酸产生苯乳酸，但其中苯丙氨酸的转化率较低，而苯丙酮酸虽然转化率高但其理化性质不稳定且成本较高，使得通过生物转化法来制备苯乳酸难以实现工业化生产。

本发明从土壤中分离得到一株高产天然食品防腐剂苯乳酸的醋酸菌——葡糖醋杆菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97，并提供了从该菌发酵制备苯乳酸的方法，为以后苯乳酸工业化生产的微生物筛选拓展了范围，相关的研究未见报道。

技术实现要素：

本发明提供一株高产苯乳酸的葡糖醋杆菌（Gluconacetobactersp.）菌株FBFS 97，其保藏编号为：CCTCC M 2016388。

上述菌株由本实验室从土壤中分离得到。

本发明的第二个目的是提供一种从葡糖醋杆菌FBFS 97发酵液中制备苯乳酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：采用上述葡糖醋杆菌FBFS 97进行液态发酵，获得富含苯乳酸的发酵液，再通过萃取法得到苯乳酸。

上述方法中，所述发酵的条件为30 °C，160 r/min培养17 d。

上述方法中，添加苯丙氨酸的液态培养基配方如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，苯丙氨酸 1 mg/mL，以双蒸水配制。

上述方法中，将2%（v/v）的葡糖醋杆菌FBFS 97种子液接入添加苯丙氨酸的培养基中。

上述方法中，葡糖醋杆菌FBFS 97种子液是取一环葡糖醋杆菌FBFS 97斜面的菌体接入种子培养基中，在30 °C，160 r/min培养24 h。

上述方法中，葡糖醋杆菌FBFS 97的种子液培养基如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，以双蒸水配制。葡糖醋杆菌FBFS 97的斜面培养基如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，琼脂15 mg/mL，碳酸钙30 mg/mL，以双蒸水配制。

上述方法中，发酵液中苯乳酸的萃取，包括如下步骤：先通过高速离心（10000 r/min, 10min）去除发酵液中的菌体，后用盐酸（4 mol/L）将上清液的pH调到2.0，再用乙酸乙酯（乙酸乙酯:上清液= 3:1）萃取3次，最后用真空旋转蒸发（40 °C）去除乙酸乙酯，即得到苯乳酸产品。

上述菌株葡糖醋杆菌FBFS 97已于2016年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市洪山区八一路），保藏编号为：CCTCC M 2016388，分类命名为葡糖醋杆菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97。

本发明的实验证明，葡糖醋杆菌FBFS 97能产苯乳酸，在不添加苯乳酸的培养液（配方同前述的种子液培养基）中30 °C，160 r/min发酵13 d，培养液中苯乳酸可达95.71 mg/L；在该培养基中添加1 mg/mL 苯丙氨酸后，同样条件下，发酵17d，培养液中苯乳酸含量为412.05 mg/L，高于现有专利“一株产苯乳酸的菌株及该菌发酵法制备苯乳酸的方法”（公开号：102604858A）报道中采用乳酸菌发酵转化苯丙氨酸产生的苯乳酸含量（242.36 mg/L）。

附图说明

图1葡糖醋杆菌FBFS 97发酵液中苯乳酸含量随发酵时间的变化。

图2葡萄醋杆菌FBFS 97发酵液中苯乳酸的高效液相色谱分析。

具体实施方式

以下的实施例为了便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下面结合附图进一步详细说明本发明。

实施例1 发酵时间对发酵液中苯乳酸含量的影响：按说明书所述方法，通过高效液相色谱检测葡萄醋杆菌FBFS 97发酵液在不同发酵时间下苯乳酸的含量，发现在不添加和添加苯丙氨酸的两种条件下，发酵液中的苯乳酸含量皆随发酵时间的进行先升高后持平。在不添加苯丙氨酸的发酵液中，苯乳酸最高可达95.71 mg/L（发酵13d），在添加1 mg/mL 苯丙氨酸的发酵液中，苯乳酸最高可达412.05 mg/L（发酵17d）（图1）。

上述实例中检测发酵液中苯乳酸含量的高效液相色谱法包括如下步骤：发酵液先通过高速离心（10000 r/min, 10min）去除发酵液中的菌体，过0.22 μm膜后进行高效液相色谱分析（图2）。

上述高效液相色谱分析条件为：液相色谱Shimadzu LC-20AT，色谱柱inertsil ODS-3 4.6×250 mm，流动相为：A相：乙腈；B相：磷酸水溶液，流速1 mL/min，进样量10 μL,柱温40 °C，检测波长210 nm。

上述流动相梯度洗脱程序为：0-15min: A:B = 20:80; 17-20min = 90:10; 20.01-25min: A:B = 20:80。