本发明涉及重金属铬污染的生物修复
技术领域：
，具体地，涉及一种花园伯克霍尔德氏菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化铬的方法。
背景技术：
：铬(Cr)及其化台物是冶金、金属加工、电镀、制革、油漆、颜料等行业常用的基本原料，在上述行业的生产过程中产生大量含铬废气、废水和废渣，导致严重的环境污染问题。在环境中常见的铬的形态有三价铬和六价铬。三价铬在土壤中常以难溶氢氧化物的形式存在。溶液中的Cr3+浓度很小，所以毒性很小；六价铬溶解度大，因而毒性很强。微量的铬是人体必需的，但过量的摄入铬将导致严重的后果。六价铬和三价铬都有致癌致畸作用。多年来，世界各国普遍将铬污染列为重点防治对象。和其他重金属污染一样，铬污染的治理途径主要有两种：一是改变铬在土壤中的存在形态，将六价铬还原为三价铬，降低其在环境中的迁移能力和生物可利用性；二是将铬从被污染土壤中清除。根据这两种思路，当前的土壤修复技术主要为物理、化学方法，但均对土壤扰动大，可能引发二次污染问题，投资成本大，这些局限性制约了技术的大规模使用。而生物修复法不破坏植物生长所需的土壤环境，不会产生二次污染，可原地处理，操作简单。具体地，固定化和稳定化是将被铬污染的土壤与某种粘合剂混合(也可以辅以一定的还原剂，用于还原六价铬)，通过粘合剂固定其中的铬，使铬不再向周围环境迁移。在众多的粘合剂中，水泥和硅土被认为是一种有效、易得和价廉的产品。采用该方法修复铬污染土壤，需将土壤挖掘出来，成本 较高，处理效果也有待进一步提高。化学还原法是一种原位修复方法，利用铁屑、硫酸亚铁或其他一些容易得到的化学还原剂(也可以辅以一定的粘合剂)将六价铬还原为三价铬，形成难溶的化合物，从而降低铬在环境中的迁移性和生物可利用性，进而减轻铬污染的危害。但在处理过程中，还原剂有可能被冲走，也可能被其他物质氧化。另外，向土壤中投加的还原剂有可能造成二次污染。因此。土壤颗粒内部的六价铬的去除是化学还原法的难点。化学清洗法是利用水力压头推动清洗液通过污染土壤而将铬从土壤中清洗出去，然后再对含有铬的清洗液进行处理。清洗液可能含有某种络合剂，或者就是清水。同样化学清洗法引入的清洗剂也可能造成二次污染，且仅适宜渗透系数大的土壤。生物修复法泛指应用植物和微生物来治理铬污染。现在铬污染的治理主要集中于微生物方面，即利用原土壤中的土著微生物或向污染环境补充经过驯化的高效微生物，在优化的操作条件下，通过生物还原反应，将六价铬还原为三价铬，从而修复被污染土壤。该方法不会产生二次污染，因此筛选出一株高效铬钝化菌株应用于实际土壤修复至关重要。技术实现要素：本发明的目的是为了克服铬污染生物修复中存在的上述缺陷，提供一种花园伯克霍尔德氏菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化铬的方法。本发明的花园伯克霍尔德氏菌，具有较高的铬钝化能力，可耐受高浓度的铬污染，操作简便，可在铬污染的土壤或含铬废水的生物修复过程中发挥重要作用。为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一种具有较高的铬钝化能力、可耐受高浓度的铬污染的花园伯克霍尔德氏菌。因此，第一方面，本发明提供了一种花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderia anthina)，该花园伯克霍尔德氏菌的保藏号为CGMCCNO：10843。第二方面，本发明提供了一种含有上述花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaanthina)的菌剂。第三方面，本发明提供了上述花园伯克霍尔德氏菌和/或菌剂在钝化铬中的应用。第四方面，本发明提供了一种钝化铬的方法，所述方法包括：将上述花园伯克霍尔德氏菌和/或上述菌剂与铬污染样品接触，以对铬污染样品中的铬进行钝化。本发明的花园伯克霍尔德氏菌为重金属铬高效钝化菌株，能够降低铬在水相或土壤相中的生物可利用度。与现有技术相比，本发明的花园伯克霍尔德氏菌能够高效钝化土壤相(对土壤扰动小)或水相中的铬，可耐受高浓度的铬污染，操作简便，可在铬污染的土壤或含铬废水的生物修复过程中发挥重要作用，实现环保绿色修复的目的。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本发明的花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaanthina)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC：10843。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。第一方面，本发明提供了一种花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderia anthina)，该花园伯克霍尔德氏菌的保藏号为CGMCCNO：10843。本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌，为革兰氏阴性菌，属于伯克氏菌科伯克霍尔德属花园伯克霍尔德氏菌。该菌株来源于安徽宣城铬污染土壤，采用土壤环流方式筛选并通过稀释平板方法分离纯化得到。生物学特性为：弯曲短杆状、无芽孢、白色圆形凸起；革兰氏染色实验、产H2S实验、淀粉酶实验阴性，明胶液化试验、氧化酶试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验阳性，可利用甘露糖。其中，本发明的花园伯克霍尔德氏菌的分离过程可以包括：将100g土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流富集装置的上层，200mlLB培养基作为环流液置于下层。启动蠕动泵，富集过程中根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。富集结束后，取上层土壤与下层环流液，并将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取适量涂布于含有50、100、200、300mg/LCr6+的LB固体培养基上，25-30℃培养3天后取菌株进行平板划线，分离单菌落。本发明从筛选出的菌株中获得了一株对重金属铬耐抗性最强的菌株W-10，对该菌株进行生理生化鉴定分析，其生物学特性为：弯曲短杆状、无芽孢、白色圆形凸起；革兰氏染色实验、产H2S实验、淀粉酶实验阴性，明胶液化试验、氧化酶试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验阳性，可利用甘露糖。同时，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampbacteriaDNAkit)步骤提取该菌株的DNA，进行16SrDNA基因序列分析，其16srDNA基因序列如SEQIDNO.1所示，结果表明该菌为花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaanthina)。将该花园伯克霍尔德氏菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO：10843。本发明提供的花园伯克霍尔德氏菌经过培养能够产生大量花园伯克霍尔德氏菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述花园 伯克霍尔德氏菌增殖即可，例如，可以按照107CFU/mL的接种量将花园伯克霍尔德氏菌的活菌体接种于LB培养基中，在25-38℃的温度下培养12-36小时后，得到培养液。本发明中，对于花园伯克霍尔德氏菌的培养条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种培养条件，例如，培养时所用的LB液体培养基的组成可以为：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠，pH＝6.8-7.0。固体LB培养基中还含有2.5-3.0重量％的琼脂。培养时所用的无机盐培养基的组成可以为：0.8-1.2重量％KH2PO4，0.8-1.2重量％K2HPO4，1-1.5重量％NH4NO3，0.03-0.08重量％MgSO4，0.001-0.003重量％CaCl2，0.01-0.03重量％FeSO4·7H2O，pH＝6.0-7.5。本发明可以进一步分离上述培养液中的花园伯克霍尔德氏菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。本发明还可以进一步从花园伯克霍尔德氏菌的活菌体中得到细胞内提取物，对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。第二方面，本发明提供了含有保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaanthina)的菌剂。本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的花园伯克霍尔德氏菌的活菌体和死菌体均能够有效对重金属铬进行钝化。因此，如上所述的花园伯克霍尔德氏菌的菌体可以为活菌体，也可以为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体，即菌剂含有所述花园伯克霍尔德氏菌的死菌体和/或活菌体。但更令人惊奇的是，本发明的发明人进一步发现，本发明提供的花园伯克霍尔德氏菌的细胞内提取物，对重金属铬的钝化效果更佳，因此， 优选情况下，菌剂含有所述花园伯克霍尔德氏菌的细胞内提取物。根据本发明，对于以上死菌体的制备方法没有特别的限制，例如但不限于，可以通过自然裂解制备，也可以通过热致死制备，还可以通过冰浴条件下超声破碎制备，其中以冰浴条件下超声破碎制备效果最优。对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。本发明中，对菌剂中所述花园伯克霍尔德氏菌的浓度或细胞内提取物的量没有特别的限定，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。第三方面，本发明提供了上述花园伯克霍尔德氏菌和/或菌剂在钝化铬中的应用。优选情况下，铬源为铬污染的土壤或含铬废水。本发明中，“钝化铬”是指降低铬污染样品中重金属六价铬的含量及其生物有效性，从而达到修复重金属铬污染的环境的目的。第四方面，本发明提供了一种钝化铬的方法，该方法包括：将保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌和/或含有保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌的菌剂与铬污染样品接触，以对铬污染样品中的铬进行钝化。本发明方法中，对于接触的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种的方法，例如可以在铬污染样品中加入保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌和/或含有保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌的菌剂，混合均匀。本发明的方法中，本发明的发明人在研究中发现，在铬污染样品中加入 一定量的花园伯克霍尔德氏菌的营养源能够有效加速铬的钝化。因此，优选情况下，该方法还包括：在铬污染样品中加入营养源，进一步优选地，所述营养源为营养肉汤培养液、玉米粉蛋白胨培养液、酵母膏蛋白胨培养液、LB培养液和无机盐培养液中的至少一种。本发明方法中，优选情况下，所述样品为土壤或含铬废水。本发明方法中，对于加入至铬污染样品中的花园伯克霍尔德氏菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述花园伯克霍尔德氏菌能够在所述铬污染样品中起作用并且对重金属铬有效钝化即可，加入的所述花园伯克霍尔德氏菌的形式，例如，可以为培养至对数期的菌体或菌液，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，还可以为其细胞内提取物。本发明对加入的花园伯克霍尔德氏菌的数量和菌剂的量也没有特别的限制，这可以根据所述铬污染样品中的铬的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述样品中的铬含量较高或较难钝化或对于所述花园伯克霍尔德氏菌的生存较不利时，可以提高所述花园伯克霍尔德氏菌的接种量和菌剂的加入量；当所述样品中的铬含量较低或较易钝化或对所述花园伯克霍尔德氏菌的生存的影响较小时，可以减少所述花园伯克霍尔德氏菌的接种量和菌剂的加入量。根据本发明，当铬污染样品为土壤时，为了进一步促进本发明提供的花园伯克霍尔德氏菌对铬的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。实施例以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。以下实施例和对比例中的实验方法中，如无特殊说明，均为本领域常规 方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。六价铬去除率＝(处理前六价铬含量-处理后六价铬含量)/处理前六价铬含量×100％。制备例将本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌在LB液体培养基中活化2次，每次活化均在170rpm、30±1℃下进行12小时，得到菌液，将得到的菌液以3体积％的接种量接种于300mlLB液体培养基中，在170rpm、30±1℃的培养条件下进行培养，3h后进入对数期，9h后到达稳定期，菌浓度OD600约为7。实施例1本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌在水相中对铬的耐受性及钝化能力向300mlLB液体培养基中加入重铬酸钾，使Cr6+浓度分别为50mg/L、100mg/L和200mg/L，121℃下灭菌15min。向灭菌后的前述LB培养基中以3体积％的接种量接入制备例得到的菌液。170rpm，30±1℃下培养，取样测菌液OD600值及六价铬的浓度并计算六价铬去除率。其中，六价铬的浓度用ICP-AES法进行测定，测定方法包括：取适量菌液，8000rpm离心5min，取上清液，采用ICP-AES检测上清液中Cr6+浓度，ICP-AES的条件包括：测定波长为267.7nm。结果显示：12h时，在Cr6+浓度为50mg/L、100mg/L和200mg/L下，该菌株能达到的最高OD600值分别为4.33、6.23和7.37，对Cr6+的去除率分别为45.33％、55.60％和83.9％。表明本发明的保藏号为CGMCCNO：10843 的花园伯克霍尔德氏菌不仅能够耐受高浓度的铬污染，而且还有较高的铬钝化能力。实施例2本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌在寡营养条件下对土壤中铬的钝化效果将100mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将菌液在8000rpm下离心5min，将得到的菌体用无菌去离子水进行水洗并重悬制成100ml菌的水溶液，然后将该菌的水溶液加入到1kg重金属铬的污染土壤(六价铬含量为52.36mg/kg)中，再加入适量无菌去离子水，搅拌均匀，培养20d，保证每天土壤的含水量为20％。20天后，将土壤在70℃下烘干，准确称取0.5g，加入10ml65重量％的HNO3后在195℃下微波消解20min，取上清液过滤，用ICP-AES测定Cr6+含量。土壤中Cr6+由52.36mg/kg降到23.88mg/kg。表明经此菌株处理过的铬污染土壤中铬的含量明显下降，说明在寡营养条件下，该菌株对土壤中重金属铬的钝化具有良好的效果，能够有效降低铬在土壤中的生物可利用度。实施例3本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌在富营养条件下对土壤中铬的钝化效果将100mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将前述菌液加入到1kg重金属铬的污染土壤(六价铬含量为52.36mg/kg)中，加入适量无菌去离子水，搅拌均匀，培养20d，保证每天土壤的含水量为20％。20天后，将土壤在 70℃下烘干，准确称取0.5g，加入10ml65重量％的HNO3后在195℃下微波消解20min，取上清液过滤，用ICP-AES测定Cr6+含量。土壤中Cr6+由52.36mg/kg降到8.38mg/kg。表明经此菌株处理过的铬污染土壤中铬的含量明显下降，说明在富营养条件下，该菌株对土壤中重金属铬的钝化具有良好的效果，且明显优于寡营养条件，能够更有效降低铬在土壤中的生物可利用度。实施例4本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌在水相中不同形态对六价铬的钝化能力将100mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将菌液4℃离心取上清，即为上清样品。用10mmol/LTris-HCI缓冲液(pH7.0)洗涤前述得到的菌体2次后重悬，平均分成3份。一份不作处理，即为静息细胞样品；一份加入1体积％甲苯和0.2体积％TritonX-100振荡，即为渗透性细胞样品；一份在冰浴条件下超声破碎，超声频率为25KHz，超声时间为20min，4℃离心取上清，即为细胞内提取物样品。四份样品分别加入一定量的重铬酸钾，使Cr6+浓度为50mg/L。12h后离心并测定上清液中的Cr6+浓度，六价铬去除率结果如表1所示。表1项目六价铬去除率上清样品25.8％静息细胞样品57.6％渗透性细胞样品73.6％细胞内提取物样品88.5％由表1可以看出，细胞内提取物样品对六价铬去除率高达88.5％，远高于上清样品、静息细胞样品和渗透性细胞样品，表明本发明的CGMCCNO：10843的花园伯克霍尔德氏菌的细胞内提取物样品能够更有效的钝化铬。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3