一种不动杆菌败血菌、含有该菌的菌剂及其应用和钝化砷的方法与流程

本发明涉及重金属砷污染的生物修复
技术领域：
，具体地，涉及一种不动杆菌败血菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化砷的方法。
背景技术：
：砷(As)是五大剧毒元素之一。土壤中的砷主要来源于天然和人为两大途径。天然来源主要是土壤本身所含的砷元素，除富砷地区以外，大多数的土壤砷背景值约为15mg/kg。土壤砷污染主要来源于人类活动。砷元素及其衍生物被广泛用于生产制造业，如电子产品、合金和涂料等。同时金属采矿和煤炭开采活动也会释放大量的砷到土壤和大气环境中。农业生产中使用的含砷农药和化肥也是土壤中砷的一类重要来源。砷化物曾被广泛用于农业中作杀虫剂、消毒液、杀菌剂和除草剂。另外，一些化肥中也含有一定量的砷。磷肥中一般含有20-50mg/kg的砷，其中复合肥中的砷含量更高，长期施用使土壤中富集大量的砷元素，导致严重污染。无机砷化合物在土壤中持久存在，并可为植物所利用，进而毒害植物影响作物生长。鉴于砷本身的特性，必须进行人工治理和修复。可以采用的方法包括物理方法、化学方法和生物学方法，有以下几个方面：固定化/稳定化技术、玻璃化技术、土壤淋洗技术、原位电动修复技术。上述修复方法均会不同程度地破坏土壤生态环境。也就是说，目前所采用的物理、化学修复技术不仅操作复杂，而且所采用化学试剂或物理操作均会对土壤环境造成不可逆的破坏。相反，生物修复技术修复效果好、投资省、实施简便、不产生二次污染。因此，为了保持土壤结构和微生物的活性，筛选出高效钝化菌株钝化土壤中的砷是目前亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是为了克服砷污染生物修复中存在的上述缺陷，提供一种不动杆菌败血菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种钝化砷的方法。本发明的不动杆菌败血菌，具有较高的砷钝化能力，可耐受高浓度的砷污染，操作简便，可在砷污染的土壤或含砷废水的生物修复过程中发挥重要作用。为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一种具有较高的砷钝化能力、可耐受高浓度的砷污染的不动杆菌败血菌。因此，第一方面，本发明提供了一种不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)，该不动杆菌败血菌的保藏号为CGMCCNO：10855。第二方面，本发明提供了一种含有上述不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)的菌剂。第三方面，本发明提供了上述不动杆菌败血菌和/或菌剂在钝化砷中的应用。第四方面，本发明提供了一种钝化砷的方法，所述方法包括：将上述不动杆菌败血菌和/或上述菌剂与砷污染样品接触，以对砷污染样品中的砷进行钝化。本发明的不动杆菌败血菌为重金属砷高效钝化菌株，能够降低砷在水相或土壤相中的生物可利用度。与现有技术相比，本发明的不动杆菌败血菌能够高效钝化土壤相(对土壤扰动小)或水相中的砷，可耐受高浓度的砷污染，操作简便，可在砷污染的土壤或含砷废水的生物修复过程中发挥重要作用，实现环保绿色修复的目的。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为平板划线得到的单菌落图。图2为AgNO3溶液漫过不动杆菌败血菌菌落后的菌落效果图。生物保藏本发明的不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC：10855。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。第一方面，本发明提供了一种不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)，该不动杆菌败血菌的保藏号为CGMCCNO：10855。本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌，为革兰氏阴性菌，属于莫拉氏菌科不动杆菌属败血菌。该菌株来源于安徽宣城砷污染土壤，采用土壤环流方式筛选并通过稀释平板方法分离纯化得到。生物学特性包括：形态特征为在LB固体培养基上菌落为淡黄色、圆形、边缘整齐、表面湿润光滑，显微镜观察呈粗短杆状，无鞭毛；革兰氏染色试验、淀粉酶实验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、产H2S实验阴性，明胶液化试验、接触酶试验阳性，不能利用甘露糖。其中，本发明的不动杆菌败血菌的分离过程可以包括：将100g土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流富集装置的上层，200mlLB培养基作为环流液置于下层。启动蠕动泵，富集过程中根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。富集结束后，取上层土壤与下层环流液进行平板划线纯化分离：将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8， 吸取适量涂布于含有25、50、100、150、200、400mg/LAs3+的LB固体培养基上，25-30℃培养3天后取菌落进行平板划线，分离单菌落，如图1所示。本发明从筛选出的菌株中获得了一株对重金属砷耐抗性最强的菌株As‐T，对该菌株进行生理生化鉴定分析，其生物学特性包括：形态特征为在LB固体培养基上菌落为淡黄色、圆形、边缘整齐、表面湿润光滑，显微镜观察呈粗短杆状，无鞭毛；革兰氏染色试验、淀粉酶实验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、产H2S实验阴性，明胶液化试验、接触酶试验阳性，不能利用甘露糖。同时，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANampbacteriaDNAkit)步骤提取该菌株的DNA，进行16SrDNA基因序列分析，其16srDNA基因序列如SEQIDNO.1所示，结果表明该菌为不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)。将该不动杆菌败血菌菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO：10855。本发明提供的不动杆菌败血菌经过培养能够产生大量不动杆菌败血菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述不动杆菌败血菌增殖即可，例如，可以按照107CFU/mL的接种量将不动杆菌败血菌的活菌体接种于LB培养基中，在25-38℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。本发明中，对于不动杆菌败血菌的培养条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种培养条件，例如，培养时所用的LB液体培养基的组成可以为：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠，pH＝6.8-7.0。固体LB培养基中还含有2.5-3.0重量％的琼脂。培养时所用的无机盐培养基的组成可以为：0.8-1.2重量％KH2PO4，0.8-1.2重量％K2HPO4，1-1.5重量％NH4NO3，0.03-0.08重量％MgSO4，0.001-0.003重量％CaCl2，0.01-0.03重量％FeSO4·7H2O，pH＝6.0-7.5。本发明可以进一步分离上述培养液中的不动杆菌败血菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。本发明还可以进一步从不动杆菌败血菌的活菌体中得到细胞内提取物，对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。第二方面，本发明提供了含有保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌(Acinetobactersepticus)的菌剂。本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的不动杆菌败血菌的死菌体和活菌体均能够有效对重金属砷进行钝化。因此，如上所述的不动杆菌败血菌的菌体可以为活菌体，也可以为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体。即菌剂含有所述不动杆菌败血菌的死菌体和/或活菌体。但更令人惊奇的是，本发明的发明人发现，本发明提供的不动杆菌败血菌的细胞内提取物，对重金属砷的钝化效果更佳，因此，优选情况下，菌剂含有所述不动杆菌败血菌的细胞内提取物。根据本发明，对于以上死菌体的制备方法没有特别的限制，例如但不限于，可以通过自然裂解制备，也可以通过热致死制备，还可以通过冰浴条件下超声破碎制备，其中以冰浴条件下超声破碎制备效果最优。对于得到细胞内提取物的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为在冰浴条件下对菌体进行超声破碎，离心取上清。本发明中，对菌剂中所述不动杆菌败血菌的浓度或细胞内提取物的量没有特别的限定，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为 本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。第三方面，本发明提供了上述不动杆菌败血菌和/或菌剂在钝化砷中的应用。优选情况下，砷源为砷污染的土壤或含砷废水。本发明中，“钝化砷”是指降低砷污染样品中重金属砷(As3+)的含量及其生物有效性，从而达到修复重金属砷污染的环境的目的。第四方面，本发明提供了一种钝化砷的方法，该方法包括：将保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌和/或含有保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌的菌剂与砷污染样品接触，以对砷污染样品中的砷进行钝化。本发明方法中，对于接触的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种的方法，例如可以在砷污染样品中加入保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌和/或含有保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌的菌剂，混合均匀。优选情况下，所述样品为土壤或含砷废水。本发明方法中，对于加入至砷污染样品中的不动杆菌败血菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述不动杆菌败血菌能够在所述砷污染样品中起作用并且对重金属砷有效钝化即可，加入的所述不动杆菌败血菌的形式，例如，可以为培养至对数期的菌体或菌液，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，还可以为其细胞内提取物。本发明对加入的不动杆菌败血菌的数量和菌剂的量也没有特别的限制，这可以根据所述砷污染样品中的砷的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述样品中的砷含量较高或较难钝化或对于所述不动杆菌败血菌的生存较不利时，可以提高所述不动杆菌败血菌的接种量和菌剂的加入量；当所述样品中的砷含量较低或较易钝化或对所述不动杆菌败血菌的生存的影响较小时，可以减少所述不动杆菌败血菌的接种量和菌剂的加入量。根据本发明，当砷污染样品为土壤时，为了进一步促进本发明提供的不 动杆菌败血菌对砷的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。实施例以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。以下实施例和对比例中的实验方法中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。砷去除率＝(处理前As3+含量-处理后As3+含量)/处理前As3+含量×100％。制备例将本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌在LB液体培养基中活化2次，每次活化均在170rpm、30±1℃下进行12小时，得到菌液，将得到的菌液以3体积％的接种量接种于300mlLB液体培养基中，在170rpm、30±1℃的培养条件下进行培养，2h后进入对数期，12h后到达稳定期，菌浓度OD600约为6。实施例1本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌的氧化效果将300mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。取1ml菌液，按照10-3、10-4、10-5稀释后分别均匀涂布于LB固体培养基上，3天后均长出淡黄色圆形菌落，然后在LB固体培养基的一侧均分别添加1ml新配制的5重量％AgNO3溶液， 使AgNO3溶液分别漫过菌落，静置30min，如图2(图2中从左到右依次对应10-3、10-4、10-5稀释后的菌落图)所示，观察到AgNO3溶液漫过区域明显变黑，表明该菌具有很强的氧化性。实施例2本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌在水相中对砷的耐受性及钝化能力向300mlLB液体培养基中加入As3+溶液(将As2O3溶解于37.5％的HCl溶液中，得到As3+溶液)，使As3+浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L和250mg/L，将培养基的pH值调节为7.0后121℃灭菌15min。分别向灭菌后的前述LB液体培养基中以3体积％的接种量接入制备例得到的菌液。170rpm、30±1℃下培养，取样测菌液OD600值及As3+的浓度并计算As3+去除率。其中，As3+的浓度用ICP-AES法进行测定，测定方法包括：取适量菌液，8000rpm离心5min，取上清液，采用ICP-AES检测上清液中As3+浓度，ICP-AES的条件包括：吸收波长为189.0nm。结果显示：48h时，在As3+浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L和250mg/L下，该菌株能达到的最高OD600值分别为5.20、6.55、7.07和6.32，对As3+的去除率分别为43.66％、65.20％、88.0％和66.0％。表明本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌不仅能够耐受高浓度的砷污染，而且还有较高的砷钝化能力。实施例3本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌对土壤中砷的钝化效果将100mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，接入1体积％的制备例 得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。然后将前述菌液加入到1kg重金属砷污染土壤(As3+含量为49.33mg/kg)中，加入适量无菌去离子水，搅拌均匀，培养15d，保证每天土壤中含水量为20％。15天后，将土壤在70℃下烘干，准确称取0.5g，加入10ml65％重量％的HNO3后在195℃下微波消解20min，取上清液过滤，用ICP-AES测定As3+含量。土壤中As3+由49.33mg/kg降到8.26mg/kg。表明经此菌株处理过的砷污染土壤中砷的含量明显下降，说明该菌株对土壤中重金属砷的钝化具有良好的效果，能够有效降低砷在土壤中的生物可利用度。实施例4本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌在水相中不同形态对砷的钝化效果将100mlLB液体培养基在121℃下灭菌15min，然后接入1体积％的制备例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培养12h。将菌液平均分成2份，一份4℃离心取上清，即为上清样品；另一份121℃灭菌15min，然后将菌液4℃离心取上清，即为高温灭菌样品。用10mmol/LTris-HCI缓冲液(pH7.0)洗涤与上清样品对应的离心得到的菌体2次后重悬，然后在冰浴条件下超声破碎，超声频率为25KHz，超声时间为20min，4℃离心取上清，即为细胞内提取物样品。3份样品分别加入一定量的As3+溶液(将As2O3溶解于37.5％的HCl溶液中，得到As3+溶液)，使As3+浓度为200mg/L，并调节样品最终pH值为7.0。48h后离心并测定上清液中的As3+浓度，As3+去除率结果如表1所示。表1项目As3+去除率上清样品32.8％高温灭菌样品22.4％细胞内提取物样品87.5％由表1可以看出，细胞内提取物样品对As3+去除率高达87.5％，远高于上清样品和高温灭菌样品，表明本发明的CGMCCNO：10855的不动杆菌败血菌的细胞内提取物样品能够更有效的钝化砷。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3