专利名称：：使用转化的贝利不动杆菌adp1作为生物传感器检测甲苯和二甲苯的方法
技术领域：
：本发明涉及生物传感器，尤其是用于检测污染化合物的生物传感器，并且涉及生产生物传感器的方法。本发明还涉及鉴定编码响应于特定4b合物的调节蛋白的基因和/或启动子的新方法。
背景技术：
：通常，已知两种类型的生物传感器(Belkin(2003)CurrentOpinioninMicrobiol6:206-212)。第一种类型的生物传感器4夸生物材泮+与孩i电子系统或装置结合，乂人而可以快速和准确^r测才羊品或环境，如体液、水或者空气中的特定化合物。这种类型的生物传感器一4殳依赖于酶与其底物之间的特异性相互作用，或依赖于抗体与抗原之间的iK别，或依赖于輩巴分子乂于其受体的可达〗生(accessibility)，或者依赖于核酸链对其互补序列的高度亲和性。第二种类型的生物传感器，也是本发明的关注点之一，使用活的、完整细胞来才企测特定化合物。该系统使得可以检测发生在细胞中、并且不容易被电子模拟的非常复杂的反应。这种类型的生物传感器还可以测定生物利用度(bioavailability)和毒性，这不能通过^使用孩i电子系统来^皮可靠地测定。例如，4吏用第一种类型的系统可以确定样品(比如说水或者土壤)中的化合物的量，但是不能确定生物可利用的4b合物的量。通常，如果4匕合物不是生物可利用的或者为无毒的形式，那么其存在不是问题，生物可利用度和/或毒性只能够通过^f吏用活的完整细胞来可靠地确定。生物可利用和/或毒性化合物的检测重要的一个领域是评价地下水玷污或者污染和毒性化合物水平。特别是，研究已经被鉴定为在纟至;齐合4乍暨发展纟且纟只(OrganizationforEconomicCo-operationandDevel叩ment;OECD)2020年环境展望(OECD，2001)的"红灯(危险警告，redlight)"名单中的化合物。普通的;也下水污染4匕合物包括芳香族溶剂，如苯、曱苯、乙苯和二甲苯异构体(BTEX)，氯化化合物(例如，三氯乙烯(TCE)),硝酸盐，和来自农业径流(agriculturalrunoff)的杀虫剂，力口多王不芳烃(PAH;例i口，萘、荧蒽、芘)和多氯联苯(PCB)。这些只是在水和陆地生态系统中均发现的有才几污染物的目录中的一些。已知这些有积W匕合物具有不同禾呈度的毒性、诱变性或者致癌活性。虽然传统的分析方法，如质谱、气相色谱和高压液相色谱可以4是供污染区域中的化合物的浓度的信息，但是它们不能显示化合物是否易被活的生物体同化，即它们不能评价化合物的生物利用度和毒性。评价自然中存在形式的化合物的生物利用度是场地修复(siteremediation)的重要考虑因素。传统的分析方法还需要昂贵的设备和高素质的技术人员。
发明内容才艮据第一方面，本发明提供了生产用于4企测特定化合物的生物传感器的方法(1)将编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因克隆到第一质粒的第一位置中；(2)将在调节蛋白和特定化合物都存在下^^激活的启动子克隆到第一质粒的第二位置中或克隆到第二质粒中；(3)将编码调节蛋白的克隆基因、和克隆启动子整合到宿主生物体的染色体中，其中启动子被可操作地连接到用于检测启动子的激活的元件(装置，means)。优选用于才企测启动子激活的元件产生可4企测到的信号，如-见觉信号、气味、味道或者机器可检测信号。检测启动子激活的元件可以被称为报告基因，这两个术语可交换使用。优选编码调节蛋白的基因对于宿主生物体是异源的。优选启动子对于宿主生物体是异源的。优选编码调节蛋白的基因和启动子对于宿主生物体都是异源的。在本发明的上下文中，异源采用其通常含义，即启动子和/或调节基因是来自与宿主生物体不同的、但是可能相关的物种。编码调节蛋白的基因和/或启动子可以是已知的序列。可替换;也，编石马调节蛋白的基因和/或启动子可以是未知的序列。术语"响应"表示由克隆的基因编码的调节蛋白在特定化合物存在时，它引起特定启动子(一般是克隆的启动子)的激活的情况。启动子的激活可以通过调节蛋白和/或特定4b合物结合到启动子来实现。特定化合物可以造成调节蛋白结构的构象变化，这可以使其结合到启动子并且激活启动子。可^#换地，启动子的激活可以通过级联型反应来发生，其不涉及调节蛋白和/或特定化合物与启动子之间的直4姿相互作用。编码调节蛋白的克隆基因，和/或克隆的启动子，可以直接/人一个或多个质粒被整合到宿主生物体的染色体中。可^弄换地，克隆的基因和/或克隆的启动子可以通过PCR/人质粒中扩增，然后PCR产物可以^皮克隆到宿主生物体的染色体中。优选编码调节蛋白的克隆基因、和克隆的启动子通过同源重組-波整合到宿主生物体的染色体中。优选编码调节蛋白的克隆基因、和克隆的启动子，与同源于宿主生物体染色体区域的序列侧翼相接，其可以4吏克隆的基因和克隆的启动子重组到宿主生物体的染色体中。优选，克隆的基因和克隆的启动子与不同的序列侧翼相接，使得克隆的基因和克隆的启动子会在不同位置整合到宿主染色体。可以实现同源重组的侧翼序列可以非常接近克隆的基因和/或克隆的启动子，即在几个石威基对之内，或者侧翼序列可以在一定3巨离之外，例如几十个或者几百个i咸基对之外。侧翼序列离克隆的基因和/或克隆的启动子越远，会被整合到宿主生物体的染色体中的质粒DNA越多。在一个实施方案中，质粒可以包含可操作地连接到用于检测启动子激活的元件(报告基因)的克隆的启动子，并且克隆的启动子和用于纟佥测启动子激活的元件随后可以#:一起重组到宿主生物体的染色体中。在这个实施方案中，侧翼序列可以在一定距离之外，即至少在启动子和用于检测启动子激活的元件的长度之外。在另外一个实施方案中，通过PCR引入用于与宿主生物体的染色体同源重组的侧翼序列，并且整合到宿主生物体的染色体中的是PCR产物。如果宿主生物体具有Sal操纵子，侧翼序列可以是Sal操纵子的一部分。Sall喿纟从子〗吏生物体可代/谢水杨酸盐。通过4吏用部分SalA作为编码调节蛋白的基因的侧翼序列，基因可以被整合到宿主生物体的染色体中。SalR是Sal操纵子的调节蛋白，当被表达时，引起SalA的表达。在水杨酸盐存在下生长的生物体内，SalR是组成性表达的(constitutivelyexpress)。因此，如果编石马调节蛋白的基因祐:克隆到宿主生物体的SalA基因中，那么宿主生物体在水酸盐存在下生长，SalR调节蛋白会被表达并且会引起SalA基因和/或被克隆到SalA基因中的编码调节蛋白的克隆基因的表达。通过使用同源重组来将克隆的基因和克隆的启动子整合到宿主生物体的染色体DNA中，可以控制整合到染色体中的位点。通过控制整合位点，可以控制克隆的DNA的表达。还可以避免破坏对宿主生物体重要的基因。作为同源重组的^^换方法，克隆的基因和/或启动子可以通过非常头见重纟且(illegitimaterecombination)-故引入宿主染色体中。4尤选，-使用的非常规重组方法是"同源性协助的非常少见重组(homologyfacilitatedillegitimaterecombination)，，，其中净皮整合的一,殳DNA只有一侧是与受体基因组同源的(VriesandWackernagel2002PNASvol99no4pg2094-2099)。在宿主生物体的染色体中定位编码调节蛋白的克隆的基因和克隆的启动子，该系统是非常稳定的。之前，细菌生物传感器已经使用质粒负载(或携带，borne)的基因来帮助才企测样品或者环境中的化合物，这样的生物传感器要求质粒被细菌保留。质粒的保留需要将选4奪性压力施加于细菌从而保i正质粒^皮保留；一4殳这是通过将抗生素抗性基因引入到质粒中，然后将抗生素加入到细菌生长培养基中来实现的。这可能成本高，如果细菌生物传感器要被用于样品中，如环境样品，则可能是困难的。如果质粒丟失，生物传感器就不能工作，并且如果^f吏用者不知道质粒已经丢失，可能造成,i阴性。优选被生物传感器检测的化合物是污染物，优选环境污染物。术语"污染物"包括任何可以^皮—见为致污或者污染特定体系的化合物。该体系可以为土壤、地下水、任何水体、空气、人或非人机体或体液，或者任何其他合适的体系。化合物可以选自包含以下物质的组芳香族溶剂，如苯、甲苯、乙苯和二甲苯异构体(BTEX)，氯化化合物(例如，三氯乙烯(TCE)),硝酸盐(酯)，和来自农业径流的杀虫剂，如多环芳烃(PAH)如萘、荧蒽、芘，以及多氯联苯(PCB)和任何其他的污染化合物。其他的污染化合物包括燃料、溶剂、推进剂、杀虫剂的成分和这些化合物的4壬4可降解产物。优选，生物传感器只4企测生物可利用的化合物。宿主生物体可以是<壬<可合适的感受态宿主(competenthost),即任何可以接受并且重组异源DNA至其染色体的合适宿主。优选，宿主生物体是高度感受性的，并且具有大于10—6的感受性(胜任性，competence)。优选，宿主生物体表玉见出大约0.1%的整合率。举例来说，大肠杆菌(五.co//)以低于0.001%的比率整合，不是高度感受性的生物体。优选，宿主生物体是细菌或者酵母。优选，宿主生物体是自然感受态(naturallycompetent)。4尤选，宿主生物体能够重组从而将异源DNA引入到其染色体中。优选，宿主生物体能够4妻受异源DNA的插入，优选宿主生物体能够接受大于约lkb异源DNA的插入，优选可以接受大于约2kb的插入，更优选可以4妾受大于约5kb的插入。优选，宿主生物体是不动杆菌(」c/"e/oZ)""er)物种或者4艮单月包菌(尸^M(iomo"as)物种的细菌，或者是4壬4可其4也的Y细菌物种。Y细菌具有可以t聂取化学品、特别是芳香族化学品的转运系统，这使它们可用作污染化学品的生物传感器。更优选宿主生物体是贝利不动4干菌(v4c/weto6a"wZ)";^y/)。宿主生物体可以是自然产生的或通过选4奪性压力/生长而改造的或者可以已经被遗传改造。优选，宿主生物体能够表达克隆的基因。一些细菌遇到的问题是它们不一定能够表达异源DNA。例如，大肠杆菌(Eco/O经常具有表达来源于其他的细菌的基因的困难，大肠杆菌不能表达dmpR-最初来源于《叚单月包菌(尸化wcfowowas5p.)CF400的苯酚调节蛋白(phenolregulatoryprotein)。优选，宿主生物体是安全和易于操作的。当克隆的启动子^皮整合到宿主生物体的染色体中时，克隆的启动子可操作地连接到用于检测启动子激活的元件/报告基因上。可操作地连接表示启动子和报告基因被安排为在启动子被激活时，报告基因即被表达。优选，当启动子未被激活时，在宿主生物体中没有或者基本没有报告基因的表达。优选，在整合到宿主生物体的染色体之前，在质粒中才艮告基因可l喿作地连接至启动子。优选，才艮告基因和启动子一起整合至宿主生物体染色体上。可替换地，报告基因和启动子可以分别整合到宿主染色体中；如果一旦被整合，它们就净皮可#:作地连4妾。优选，当由于克隆的启动子的激活而^皮表达时，才艮告基因产生可才佥测到的信号。可4全测到的信号可以是酶功能、代i射功能或基因表达的改变。优选表达的报告基因的量与样品中的生物可利用的特定化合物的量相关。优选，报告基因的表达可以通过比色法测量或者光度法测量，例如通过荧光测定法(flourimetery)。才艮告基因可以表达P-半乳糖普酶，其可以通过比色法检测。可替换地，报告基因可以为萤火虫荧光素酶基因或者绿色荧光蛋白(GFP)基因中的一种或多种，其表达可以通过光度法测量或者荧光测定法(flourimetrically)测量。优选，净艮告基因是/wx^、/wxB、/wxC、/wxD和/w:c五中的一种或多种。优选，使用不具有其天然启动子的报告基因，通过克隆的启动子来启动其表达。优选，当被整合到宿主生物的染色体中时，编码调节蛋白的克隆的基因是组成性表达的。该基因可以在所有生理条件下，或者只在某些条件下(如被用于测试样品的那些条件下)，是组成性表达的。可操作地连接到调节基因的启动子可以是与宿主生物体同源或者异源的。定化合物与编码调节蛋白的克隆的基因的表达产物的结合或者相互作用来工作。优选编码调节蛋白的克隆的基因的表达产物与特定化合物之间的相互作用导致对克隆的启动子的诱导，其导致报告基因的表达。优选特定化合物与编码调节蛋白的克隆的基因的表达产物(调节蛋白)之间形成复合物，并且该复合物激活/诱导克隆的启动子和引起报告基因的表达。优选克隆的启动子，和编码调节蛋白的克隆的基因都来自生物体代;射特定化合物(生物传感器用于监控A险测该特定化合物)所4吏用的操纵子。某些细菌已经进化了使用污染化合物作为食物来源的能力。产生需要的代谢酶来利用污染化合物通常受控于特定类型的调节蛋白，该调节蛋白通过直4妄的物理相互作用才企测污染化合物。然后，该蛋白-化学品复合物结合到相关的(同源的，cognate)启动子序列，并且激活编码所需代谢酶的基因的表达。这种类型的调节蛋白，及其相关的启动子，可以;故用作本发明的生物传感器中的污染物检测组件(成分)。可以设计合适的宿主生物体，使得由调节蛋白激活的可诱导启动子可操作地连接到才艮告基因，从而污染化合物与调节蛋白的相互作用激活驱使报告基因表达的启动子。报告基因的表达4是供可测量的信号，其反映了污染化合物的存在，优选污染化合物水平(含量)和报告基因的表达水平之间存在相关性。例如，对污染化合物，如苯酚、曱苯、苯、萘和二曱苯的代"i射所需要的基因进行编码的操纵子，已经得到透彻的了解，并且对调节蛋白、其相应的基因和来自这些操纵子的可诱导的启动子可以进4亍改造乂人而用于本发明的方法和传感器中。本发明中使用的调节蛋白和启动子将取决于要被检测的目标化合物。例如，如果目标化合物是曱苯或者二曱苯，那么启动子可以是Pu启动子，调节基因可以是xy/R,两者都来源于恶臭H单月包菌(i^ewdowo"osjw"/a)。如果目标化合物是萘，可以4吏用由nahR蛋白调节的降解操纵子nahG(KingJMHetal.(1990)Science249(4970):778-781)。编码调节蛋白的克隆的基因，和/或克隆的启动子可以是天然产生的，或来源于天然产生的基因，或是合成的。例如，编码调节蛋白的基因，和/或启动子，可以从天然代谢所关注化合物的细菌中分离。该基因和/或启动子可以以它们天然产生的形式来^吏用，或者它们可以是变异的或者^皮切割的。例如，该基因和/或启动子的DNA序列可以经变异从而使其能够在宿主生物体中起作用或改善其功能，或者改善其整合至宿主生物体中。只要编码调节基因的克隆的基因，和克隆的启动子一起工作使得可以检测宿主生物体中的特定化合物，那么克隆的基因和克隆的启动子的序列则并不重要。本领域中的普通技术人员会认识到任何合适的(一种或多种)质粒都可以被用于本发明的方法。质粒必须能够整合和保留克隆的基因和/或启动子。优选带有克隆的基因和/或启动子的质粒可以在细菌宿主中复制以<更繁殖质粒。质粒优选还可以#皮感受态宿主生物体吸收，并且^^f呆留在宿主生物体内，同时发生质粒和宿主生物体的染色体之间的同源重组。所属领域的普通才支术人员可以在该质粒中加入所有合适的调节序列，如启动子、终止子、聚腺苦酸化序列、标记基因、用于重组的侧翼序列、抗生素筛选基因和任何其他合适的序列。可形成用于本方法的质4立基础的质并立的实例为可购自PromegaTM的pGEM⑧质斗立和Invitrogen/〉司的TOPOTM质4立。可以使用一种或两种质粒来实施本发明的方法。如果使用一种质斗立，优选编码调节蛋白的基因和启动子^皮克隆到质冲立中分隔的4立置。这可以通过使用不同的限制酶来实现。如果使用两种质粒，优选编码调节蛋白的基因，和启动子被克隆到不同的质粒。在两种情况下，编码调节蛋白的基因、和启动子都优选与可使它们整合到宿主生物体的染色体的不同位点中的不同序列侧翼相接。优选通过本发明的方法生产的生物传感器能够检测纳摩尔水平(含量)的特定化合物，使它们如同传统的色谱法或者分光光度法一样灵敏或者比那些方法更加灵敏。此外，因为没有背景表达或者只有很低的背景表达，(1)编码调节蛋白的基因、(2)启动子和(3)报告基因的染色体整合产生了比质粒负载系统(或质粒介导系统，plasmidbornesystem)更灵敏的系统。在其中有多个基因拷贝，特别是多个报告基因拷贝的质粒系统中，即使可诱导的启动子只是轻微的"渗漏(leaky)"，报告基因的低水平的背景表达也会产生,支阳性。另夕卜，因为细菌中的质粒数目可以改变，因此很难定量比较不同实验的结果。质粒拷贝数越多，可检测信号的水平则可能越高。生产生物传感器的这种方法提供了一条方<更而有效的途径乂人而当需要时能够容易地构建特定物质的生物传感器。本发明提供了一种使得能够快速(优选在约2-3天内)构造常规可诱导的(custominducible)细菌生物传感器的方法(与以前所需的数月和专业遗传学(specialistgenetics)相对)。可以理解通过参考本发明的第一方面讨-论的本发明的所有的优选特征都可以应用于本发明的所有方面。根据另外一个方面，本发明提供了生产用于特定化合物的生物传感器的方法，包含(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA池；(3)将来自DNA池的DNA片段克隆到一种或两种质粒中的第一和第二位点；(4)将克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，其中质粒中第一位点的DNA在第一位置被整合到染色体中，从而它会在宿主生物体中表达，质粒中第二位点的DNA在第二位置被整合到染色体中，从而克隆的DNA可操作地连接到报告基因；(5)将特定化合物施加至宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。优选报告基因的表达指示宿主生物体响应于特定化合物的存在，因此该生物体可以被用作该特定化合物的生物传感器。根据本发明的另一个方面，提供了鉴定(i)编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因和(ii)被调节蛋白和特定化合物激活的启动子的方法(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA片段池；(3)将来自DNA池的DNA片4史克隆到一种或两种质粒的第一和第二位点，使得当质粒被转化到宿主生物体中时，第一位点的DNA会被表达，第二位点的DNA可操作地连接到报告基因；(4)用该一种或两种质粒转化宿主生物体；(5)将特定化合物施加于被转化的宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。报告基因的表达显示宿主生物体正在表达调节基因，并且具有(associatedpromoter)。该生物体可以:故用作该净争定4匕合物的生物传感器。可替换地，通过本发明的这种方法鉴定的基因和启动子随后可以被整合到宿主生物体的染色体中从而生产特定化合物的生物传感器。在本发明的方法的步骤i中，特定4b合物可以是^f壬4可感兴趣的化合物，特别是，该特定化合物可以为环境致污物或者污染物。前文讨i仑过其实例。优选通过/人样品，如土i裏、水、空气或者流体样品分离DNA来获得本发明的方法中4吏用的DNA池。优选该才羊品^皮特定化合物所污染。优选，该才羊品含有已经进化乂人而在该特定^:合物污染的土壤、水、空气、流体等中存活的生物，并且优选某些这种生物已经进化从而代谢该特定化合物。目标是从可以代谢该特定化合物的生物体中分离可^皮用于生物4专感器中的DNA。优选DNA池含有超过一种的DNA的不同片^殳。更优选，DNA池含有10种或者更多、IOO种或者更多、500种或者更多、1000种或者更多的DNA的不同片段。优选用于产生池的DNA分离自环境样品，而无需培养样品中的细菌，这具有可以将在实验室环境下难以或者不可能培养的细菌的DNA包4舌在该池中的优势。广泛i人为，多达99%的细菌在实-验室条件下不能培养，本发明的方法确保考虑到这样的细菌的DNA,并且当生产本发明的生物传感器时被使用。通过使用DNA池，本发明的方法可以被用于克隆来自环境样品的未知的调节基因和/或启动子，或调节基因和启动子的未知组合。不需要事先了解响应于被生物传感器检测的特定化学品的调节基因和/或启动子。优选，可以使用单个DNA池来筛选响应于超过一种化学品的调节基因和/或启动子。该池中的DNA可以作为总核酸提取过程的一部分来分离，或者只是DNA被提取。21本发明的方法中使用的DNA池可以通过合适的限制酶被消化从而使其能够被克隆到质粒中。合适的酶可以包括BgIII和/或Sau3A。可替换地，可以^使用平末端(bluntend)连接来将DNA克隆到质粒中。优选DNA4皮随机插入到一种或者两种质粒的第一或第二位点中。第一和第二位点都侧翼相^妄于可使克隆的DNA同源重组到宿主生物体的染色体中的序列。克隆的DNA可以由一种或多种质斗立被直接整合到宿主生物体的染色体中，或者它可以通过PCR扩增，PCR片4殳可被整合到宿主生物体的染色体中。可^夺4奂;也，可以通过PCR来扩增克隆的DNA，PCR4吏用引物来给克隆的DNA增加侧翼序列，侧翼序列4吏得可以同源重组到宿主生物体的染色体中。优选，如果克隆的序列被整合到宿主生物体的染色体中，它们是通过同源重组来整合的。在第一位置整合至宿主染色体的、和/或质粒第一位点的DNA，优选被设置为组成性表达(至少在试验条件下)。希望该整合位置使得编码调节蛋白的基因能够被捕获。在第二位置整合至宿主染色体的、和/或质粒第二位点的DNA优选被设置为位于可操作地连接到报告基因。希望该整合位置使得启动子序列能够被捕获。报告基因可以连接到质粒中的克隆的基因上，或者整合进入到宿主生物体的染色体中。优选，本发明的方法使得可以产生一种生物体，其中已经将编码调节蛋白的基因和可操作地连接到才艮告基因的启动子克隆到这样的生物体中，其中调节蛋白和启动子在特定化合物的存在下共同工作从而引起报告基因的表达。通过针对才艮告基因的表达来筛选宿主生物体，并且只选4奪响应于特定化合物表达报告基因的那些，可以鉴定用于特定化合物的潜在的调节基因和启动子组合、以及由此形成的生物传感器。感器，其中调节操纵子(regulatoryoperon)还没被分离，或者其中仅分离了部分的操纵子。本发明的方法还可以使调节操纵子涉及的基因得以鉴定和克隆以用于进一步的研究。本发明的这种方法具有的优势为使用不同的位点来俘获/捕获启动子和调节序列，而不是依赖于一个位点来捕获两者。如果序列位于远距离之外，那么单一位点不能将两者都捕获，同样如果序列以相反的方向取向，那么单一位点捕获不能使得两个序列都起作用。根据另外一个方面，本发明提供了鉴定编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因的方法，其包含(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA池；(3)将来自DNA池的DNA片4殳克隆到质粒中；(4)将克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，使得克隆的DNA在宿主生物体中被表达，其中染色体已经携带可操作地连23接到报告基因的启动子，并且其中启动子已知在特定化合物和未知调节蛋白的存在下4皮激活；(5)将特定化合物施加于宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。根据另一方面，本发明提供了鉴定编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因的方法，其包含(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA片段池；(3)将来自DNA池的DNA片段克隆到质粒中，从而当质粒被转化到宿主生物体中时克隆的DNA会被表达；(4)用含有克隆的DNA的质粒转化宿主生物体，其中宿主生物体携带可操作地连接到报告基因的启动子，并且其中启动子已知在特定化合物和未知调节蛋白的存在下#1激活；(5)将特定化合物施加于转化的宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。在本发明的前述两个方面中，净艮告基因的表达都显示宿主生物体携带了整合到宿主染色体中或者质粒上的编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因。这才羊的生物体可以一皮用作特定^f匕合物的生物传感器。可^齐换地，通过本发明的方法鉴定的编码调节蛋白的基因，当#皮鉴定的该基因在质粒上，可以随后^皮整合到宿主生物体的染色体中从而产生特定化合物的生物传感器。该宿主生物体还必须使可操作地连接到报告基因的启动子整合到其染色体中，其中该启动子在调节蛋白和特定化合物的存在下被激活，这样宿主生物体可以被用作特定化合物的生物传感器。优选，至少在试l全条件下，克隆的DNA是组成性表达的。生物体，可以鉴定编码调节蛋白的基因。因此该方法可以用作捕获编码调节蛋白的基因的方法，当可诸导启动子已知时还可以用作生产生物传感器的方法。根据另外一个方面，本发明提供了鉴定被响应于特定化合物的调节蛋白激活的启动子的方法，包含(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA池；(3)将来自DNA池的DNA片萃爻克隆到质粒中；(4)将克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，使得克隆的DNA可操作地连接到报告基因上，其中染色体已经携带编码响应特定化合物的调节基因的基因；(5)将特定化合物施加于宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。根据另一方面，本发明提供了鉴定被响应于特定化合物的调节蛋白激活的启动子的方法，其包含(1)鉴定特定化合物；(2)获得DNA片段池；(3)将来自DNA池的DNA片段克隆到质粒中，使得克隆的DNA可操作地连接到报告基因；(4)用含有克隆的DNA的质粒转化宿主生物体，其中宿主生物体携带编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因；(5)将特定化合物施加于转化的宿主生物体；和(6)对报告基因的表达进行筛选。在本发明的前述两个方面中，报告基因的表达显示了宿主生物体携带了或者整合到染色体中或者在质粒上的可操作地连接到报告基因的启动子，其响应于特定化合物和调节蛋白被激活。表达报告基因的生物体可以;故用作特定化合物的生物传感器。可一,换地，如果宿主生物体表达相关的调节蛋白，由本发明的方法所鉴定的携带在质粒上的启动子可以^皮整合到宿主生物体的染色体中从而生产特定化合物的生物传感器。当施加特定化合物时，编码调节蛋白的基因必然被表达。优选编码调节蛋白的基因在宿主生物体中是组成性表达的，至少在实-验条件下是这样。主生物体，可以鉴定4皮调节蛋白-敫活的启动子。因ot匕该方法可以用作捕获编码可诱导启动子的基因的方法，当编码调节蛋白的基因已知时还可以用作生产生物传感器的方法。根据另外一个方面，本发明提供了检测样品中特定化合物存在与否的方法，其包含(i)将根据本方明的方法制造的生物传感器与样品进行接触；(ii)观察生物传感器中的报告基因表达是否升高。根据另外一个方面，本发明提供了用于在样品中检测化合物的1吏用i兌明。优选生物传感器被设置在容器中，该容器将释放生物传感器至环境中的风险降低到最低。生物传感器的使用说明优选表明应怎样混合生物传感器和样品，以及怎样监控报告基因的表达。的报告基因表达的指示。根据另外一个方面，本发明提供了用于生产生物传感器的试剂盒，其包含一种或者两种质粒(具有两个克隆位点，每种质粒各有一个或者两个都在一种质粒上)、和使用本发明的方法生产生物传感器的说明。克隆位点可以为多克隆位点。27主生物体。普通技术人员会了解所谈到的关于本发明的仅一个方面的优选特征可以被应用于本发明的所有方面。在这里本发明的优选实施方案会通过实施例参照附图进行介绍，其中图1A示意'1"生示出了贝利不动4干菌(^"'w"o6"cter6"y/j/)突变体ADPl_Pu—/wx—xy/R的构建。更确切地/说，图1A示出了将启动子Pu和调节基因xy/R整合到贝利不动4干菌ADP1的染色体中以产生菌4朱ADP1—Pujwx一x;;/R所采耳又的四个步骤。图1B示出了在有或没有诱导物间-二曱苯的琼脂培养基上生长的ADPl_Pu—/wx一x少/R,使用的生长培养基是具有10mM葡萄糖的LB。图2示出了贝利不动杆菌ADPl—Pu_/wx—x_y/R中生长阶羊炎相关性(或生长阶,殳依赖性，growth-phasedependent)x_y/R/Pu基因调节。加入终浓度500pM的甲苯(A)、间-二甲苯(B)、对-二曱苯(C)或邻-二甲苯(D)作为诱导物。样品在28。C振荡孵育。图3示出了在补充了50mM葡萄糖或50mM琥珀酸盐(酯)作为口舉一碳源的基本i咅养基(或最小培养基，minimalmedium)中的ADPl—Pu一/wx—xy/R的相对生物发光表达。图3A-分别添加终浓度500jaM的甲苯(T)、间-二曱苯(M)、对-二曱苯(P)或邻-二曱苯(C))作为"^秀导物。样品在28。C振荡孵育。图3B-示出了不同温度对于Pu活性的影响。于OD600=0.5测量的绝对生物发光。图4示出了通过RNA印迹;去(Northern杂交，Northernblotting)监控的x_y/R和cj54的mRNA转录水平。Pu活性与cj54转录水平相关。图4A描述了样品的生长曲线，图4B示出了mRNA的RNA印迹和Pu活性的比较。图5示出了石友和氮对于贝利不动杆菌ADPl_Pu—/wx_x_y/R的Pu活性的影响。图5A示出了OD600的读凄t，图5B示出了5种处理的相对生物发光。图6示意性示出了从分离自地下水样品的DNA中捕获编码调节蛋白的基因和启动子的方法。图7示出了贝利不动杆菌的salR基因的部分序列，以及从该基因去除4个石咸基和减少该基因的;参漏表达(leakyexpression)的突变的详细'清况。图8是可以-坡用于将DNA序列整合到宿主生物体的染色体中的salA片段的序列表。序列包括侧翼相接卡那霉素基因的2个SalA片段，片段1和2。该序列可以被用于整合和捕获编码调节蛋白的潜在基因(potentialgene)。提供的序列反映了图1A中的部分的psalA-Km序歹'J。图9是可以^皮用于将DNA序列整合到宿主生物体的染色体中的salA和salR片段的序列表。该序列可以被用于整合和捕获潜在的启动子。提供的序列反映了图1A中在整合lux基因之前的部分pSaIR-lux序歹'J。图IO是用于产生具有突变salR基因的突变不动杆菌菌才朱的方法的示意图。图11描述了通过实施例3的捕获方法产生的阳性转化4朱(transformant)A,其中sal操纵子在水杨酸盐的存在下祐:激活，以及通过实施例3的方法产生的阴性转化株B，其中sal操纵子在水杨酸盐的存在下未^皮激活。通过生物发光来^正明sal揭j从子的激活。在所描述的图Y象中，左手边的图Y象是黑暗中的^f羊品，其i正明阳性转化林A是生物发光的，这是因为连接于salA启动子的lux基因的表达所致。右手边的图像是光照中的样品并且证明生长了比生物发光更多的转化林菌落。左边的平板中含有LB+tet+水杨酸盐，右手边的平板中含有LB+tet。图12是DNA分离凝胶，示出了可以从不动杆菌AsalR突变体的阳性转化株提取携带了捕获的salR调节基因的pRK415质粒。具体实施例方式实施例1-生产对二曱^/甲苯^^应的细菌生物传感器4吏用本发明的方法来生产对二甲苯/甲苯反应的细菌生物传感器。为了生产这样的生物传感器，恶臭假单胞菌的TOL质粒、pWWO的x_y/R基因和Pu启动子^皮整合到细菌宿主贝利不动杆菌ADP1的染色体中。更确切地r说，通过^l寻x少/R、Pu和/wxCDABE融合到贝利不动杆菌ADP1(A.baylyiADP1)的染色体中乂人而构建不动杆菌菌才朱ADPWH—Pu—/wx_Jc_y/R。通过测定生物发光升高的水平(由于可操作地连接Pu启动子的/wx基因的表达所致)，来监控Pu启动子的活性。恶臭，支单月包菌的TOL质粒、pWWO的矽/R基因编码感应曱苯/二甲苯的调节蛋白Pu是cjS"-依赖型启动子，其通过Xy/R的结合而,皮;敫5舌(Casesetal(1996)MolecularMicrobiology19:7-17)。Pu启动子调节系统是复杂的并且受到多个因素的控制(Casesetal(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118)。首先，通常见察到Pu启动子的活性取决于细菌的生长阶段。在指lt生长期，Pu活性一皮抑制(指凄t沉默，exponentialsilencing),而当进入到稳-定阶段它被快速激活。已经显示a"的性能和整合宿主因子(IHF)是生长阶段依赖型的，虽然在某些宿主，如恶臭假单胞菌中的a54的水平在不同的生长阶^殳是稳定的。其次，容易一皮利用的石灰源，如葡萄糖的存在引起分解代谢阻遏(catabolicrepression),从而在々i单胞菌和大肠杆菌宿主中抑制Pu活性。已经证明中间代谢物，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和/或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶作为恶臭假单胞菌中的Pu才中制的^[言号起4乍用(Velazquezetal(2004)JournalofBacteriology186:8267-8275)。其他的因素，如报警素(或警报子，alarmone)(p)ppGpp和温度也可以影响Pu活性。但是，不能完全理解为什么Pu活性在稳定阶段突然升高或者什么因素在调节中起到关键作用。通过将xj/R/Pu调节系统克隆到另一宿主中，在这种情况下快速产生二甲苯的良好细菌生物传感器贝利不动杆菌。最近被分类到贝利不动杆菌ADP1的不动杆菌ADP1是具有利用宽范围碳源的能力的土壤细菌(Youngetal(2005)AnnualReviewofMicrobiology59)。不动4干菌和々I单月包菌属于同一属(genus),贝利不动杆菌ADP1的基因组大小是3.6Mb,并且具有的GC含量是40%，与之相比假单胞菌具有大约5.4Mb的基因组和平均62%的GC含量。对于ADPWH—Pu—/wx—xj/R的研究显示，与在其原始宿主恶臭假单胞菌中的性能相似，Pu启动子的活性可以被曱苯，邻-、间-、对-二曱苯诱导。这些研究还证明异源启动子和编码调节蛋白的异源基因可以被整合到不动杆菌中并且具有功能。材料和方法所有的实验一式三份地进行。4b学品、细菌菌林和培^^基^f匕学品都/人Sigma-Aldrich7>司获4寻。本研究所^吏用的细菌菌才朱和质并立在表1中列出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>除非另有说明，所有的化学品都从Sigma-Aldrich公司获得并且是分才斤级"i式剂(analyticalgradereagent)。4吏用Luria-Bertani(LB)培养基或者基本培养基(MM)来培养合适的细菌。当需要的时候，使用2.5mM的水杨酸盐(钠盐)作为唯一碳源来制备水杨酸盐琼脂培养基(SAA),并且在含1.4%纯化琼脂(nobleagar)的基本培养基中固化。当合适的时候，使用终浓度分别为100[ag/ml和50|ig/ml的氨节青霉素(Amp)或卡那霉素(Km)用于大肠杆菌，加入10pg/ml的卡那霉素用于贝利不动杆菌ADP1。质粒构建^^建pS""及^"jwx(图1A,步骤1)使用(未示出)从PUC2剪切Pu启动子片段(320bp)并且与五coiI部分消化的pSalAR—/欲连4秦(图1A，步骤1)。连接_后，通过热激(heatshock)将该质粒l争到大肠4干菌感受态细月包JM109中(PromegaTMCo.厂商i兑明)然后涂布在LBAmp(100(ig/ml)上进行选4奪。随机选择16个菌落，使用引物sa/A—end_for和/"xC—rev(表2)通过PCR进4亍扩增，在95°C起始变性5min,然后94°Clmin，58°Clmin，和72。Clmin进4亍35个循环，最后再在72。C下维持10分4t来结束延伸。在PCR扩增之后，将lOpl的PCR产物加样在1%的琼脂4唐凝"交上。/人凝"交上切下四个理想的PCR片4史(大约53%p),纯化(QiagenTM凝月交清洗试剂盒，gelcleaningkit)并测序(CEQ2000XL，BeckmanLtd.)。才艮才居这些序列的结果，选择在与/wxCDABE同一方向上含有Pu的菌落，将所携带的质粒命名为pSalAR_pu—/wx(图1A，步骤1)。构建pSalA一km一;^/R重叠jE^f申PCR(OEP)产生P艮制切割位点如前所述，通过重叠延伸PCR在s"/A基因中产生EcoRI和5awHl卩艮制^f立点(Huang,W.E.etal.，(2005)EnvironmentalMicrobiol.7,1339-1348)。更详细地i井，进4亍PCR扩增，在95°C进4亍5min的初始变性，然后94°Clmin，58°Clmin,和72°Clmin进行35个循环，最后再在72°C维持10min来结束延伸。使用引物对5"/A—flank一for-s"/A—BE_rev和sa/A—BE—fwd-sa/A—revH(表2)通过菌落PCR来分別扩增两个m/A片段(m/A1和m/A2)。表2引物序列(5，—3，)备注■ya/A—flank—forCCAGCTGATCAGTTGTAGAATG在jfl/A基因之外■ya/A—EB_forGATGCTATTTTAGGGAGAATTCCACGGA产生的和5a附/ZI^f立,存、TCCAGTGTAAGTsa/A—EB—revACTTACACTGGATCCGTGGAATTCTCCCTAAAATAGCATC产生的￡coiI和SamM位点.■sa/A—revHAACAGGTTGTATTGCTGCTCGCSa/A与5fl/R之间的位点/i/xC—revGAGAGTCATTCAATATTGGCAGG在/mxC基因内GACCTGAGTATGCCCGGTAG/wxE—forTGGTTTACCAGTAGCGGCACG在/wxE基因内:>qy/Rl—forTGGATTTCAGTTAATCAATTGGT正向侧翼连4娄x_y/R_revCTATCGGCCCATTGCTTTCAC反向侧翼连接Sigma54—forATGAAGTTATCTGTTGGATTGAAAGTCGSigma54_revCACGATATTTTGCAACGGTTCTAC根据厂商说明(QIAquickTM凝胶提取试剂盒，QiagenTM公司)，从1%琼脂糖凝胶分离PCR产物，清洗并且纯化。为了融合两种m/A片段，进行PCR扩增(使用与上面相同的反应条件，除了延伸时间是72。C2分钟)，其含有稀释(1:100)的sa/Al(907bp)和sa/A2(924bp)片段和引物m/A—flank_for和sa/A—revH(表2)各1^1。才艮据制造商说明(QIAquickTM凝胶提取试剂盒，Qiagen公司)纯化带有五coiI和SamHI限制位点的新sa/A片段的PCR产物，然后克隆到pGEM-T(PromegaTM/^司)中，该质粒被命名为pSalA—BE(图IA)。构建pSalA—Km一"况(图1,步骤3)35用禾口5"wHI消4匕pSalA—BE。通过五coiI和5"mHI乂人pRMJ2(未示出)切割卡那霉素基因(1472bp)并且融合到pSalAR—BE中从而产生pSalA—Km(图1A)。将连接混合物转化到感受态细胞(大肠杆菌JM109)中并且^f吏用具有Amp(100pg/ml)和Km(50pg/ml)的LBA选择平才反(或选择培养基，selectionplate)来获得转化林(transformant)。用五coRI消4bpSalA—Km。通过乂人p:c;;/R(未示出)切割"/R基因片段(2399bp)并且融合到pSalAR—KM中从而产生pSalA—KM—x_y/R(图1A,步骤3)。将连接混合物转到感受态细胞(大肠杆菌JM109)中并且使用具有Amp(100jig/ml)和Km(50昭/ml)的LB琼脂(LBA)选择平板来获得转化林。使用引物对:^/Rl_for和x_y/R—rev(表2)来进4亍菌落PCR乂人而确定x少/R已经融合到质粒中。进行PCR扩增，在95。C初始变性5min，然后94。Clmin，50°Clmin，和72°C2min进4亍35个循环，最后再在72°C维持10min来结束延伸。基因转化按照Palmenetal.1993.JournalofGeneralMicrobiology139:295-305所描述的，进行不动杆菌ADP1感受态细胞的制备。简单来说，以不动杆菌菌林ADPW67或ADPl_pu—/wx作为受体，在5mlLB于30。C,以200rpm振荡培养(或生长，grow)过夜。然后将二百微升的培养物稀释在5ml的新鲜LB培养基中，并且孵育2小时从而4吏细月包成为感受态。为了转化，将2(ig的pSalARjpu—/wx或SalA—Km—xj/R质粒力口入到0.5ml的感受态细胞(109个细月包/ml)并且孵育2小时。随后将培养物涂布在合适的培养基上用于筛选转化林。产生不动杆菌ADPl_pu_/x(图1A,步骤2)36在图1A中示出了整合Pu启动子的方法。不动杆菌菌才朱ADPW67具有插入到m/A基因的卡那霉素基因，它不能在才是供水杨酸盐作为唯一碳源的SAA平板上生长。在整合之后，故Km基因中断的m/A基因被提供功能性s"/A基因的pSalAR_pu—/wx取代，乂人而4吏转化4朱能够在SAA上生长。为了确定Pu启动子和/wxCDABE整合到不动4干菌ADP1的染色体中，从SAA平板(plate)随机选择16个菌落，使用染色体侧翼引物和内部引物来进行PCR反应。更详细地讲，flank—for//wxC_rev引物〉寸用于Pu，sa/AR—rev〃MxE—Rvd(表2)引物乂于用于/wxCDABE。通过菌落PCR来检测转化林，随后进行凝月交清洗(gelcleaning)和测序，命名为不动杆菌菌4朱ADP_pu_/wx。产生不动杆菌ADPI_pu_/x—xy/R(图1A,步骤4)为了将x_y/R和Km基因整合到不动杆菌ADP_pu—的染色体中，如上所述将质粒pSalAJCm—x_y/R与不动杆菌ADPl_pu—/wx感受态细胞混合。混合物在30°C孵育2小时，涂布在具有10pg/ml卡那霉素的LB琼脂平4反上用于筛选。^吏用引物刈-xy/Rl_for和x少/R—rev(表2)来进行PCR从而确定"/R整合到ADPl_pu—/wx中。核苦酸测序和序列t^才斤所有的DNA冲羊品(PCR产物或质并立)在应用生物系统(Applied(dyeterminatorsequencing)进4亍测序。4吏用Blastn来进4亍DNA序列分析从而确定序列同源性。随后，使用BioEditTM(TomHall,樣t37生物系，北卡罗来纳州立大学(TomHall,DepartmentofMicrobiology,NorthCarolinaStateUniversity)沐比对和编辑DNA序列从而确定正确的插入。质粒pSalAR_Km—"/R已经被完全测序并且提交至美国国家生物技术信息中心(NCBI),登录号是DQ202262。监控和研究不动杆菌ADPl_Pu_/^—j^/Ri秀导的方法监控细菌生长和生物发光通过测量相对生物发光(由OD600分出(divide)的生物发光)来监控Pu启动子活性。对于每一测量，在每个时间点在黑色、透明底96微孔板(FisherScientific)的孔中一式三份地分析lOOjal的样品。于OD600，4吏用SynergyHT多功能酶才示4义(SynergyHTMulti-DetectionMicroplateReader)(Bio-TekTM)来测量生4勿发光。不同的i秀导物和温度不动4干菌ADPl_pu—/wx—a:j;/R的单菌落^皮分别接种在30ml的磁璃通用管中的5mlLB培养基中。将曱苯，邻-、间-或对-二甲苯，苯酚，苯，萘，2-、3-或4-羟基苯曱酸、苯曱酸盐或儿茶酚加入到LB(100iiM)中从而测-验Pu的资导。在20、28、30、34或37。C下以150rpm振荡孵育样品。在孵育的30小时中，样品反复加入到黑色96微孔板用于生物发光和OD600测量。在以葡萄糖或琥珀酸盐作为唯一碳源的J^^养基中生长为了检验分解代谢阻遏的影响，将不动杆菌ADPl_pu—/wx_x_y/R接种在30ml玻璃通用管中的添加50mM葡萄糖或琥珀酸盐作为唯一碳源的5mlMM中。在培养基中分别加入曱苯，邻-、间-、对-二甲苯(500(iM)作为诱导物。细菌样品在28°C的振荡器中以150rpm振荡孵育。为了鉴定Pu阻遏的信号分子，在不动杆菌ADP1_pu_/wx—x;;/R的生物发光净皮间-二曱苯最大考呈度地i秀导之后，在MM-葡萄糖培养基中以O.l、1、10、30、60或300pM的终浓度加入6-磷酸葡萄糖酸三钠盐(Sigma-Aldrich公司)，其被认为是阻遏的信号分子。对于每一个处理进行三个重复。取样，每30分钟测量生物发光和OD600。碳氮比对Pu活性的影响为了检测碳和氮对Pu活性的影响，将不动杆菌ADP1_pu_/wx_x_y/R分别接种在五种不同的培养基中(1)只是1:2稀释的lb培养基；(2)具有500kM间-二曱苯的1:2稀释的lb培养基；(3)具有500(iM间-二甲苯和19mMNH4C1的1:2稀释的LB培养基；(4)具有500pM间-二曱苯和20mM葡萄糖的1:2稀释的LB培养基；(5)具有500pM间-二甲苯、20mM葡萄糖和19mMNH4Cl的1:2稀释的LB培养基。细菌样品在28。C、150rpm振荡孵育。在25小时的孵育中，将样品重复加入黑色96孔孩t孔才反来进4亍生物发光和OD600测量。RNA斑点印迹法(Northern斑点杂交，Northerndotblotting)使用RNA斑点印迹法来^r测在诱导过程中不动杆菌ADP1—Pu__/wx-x_y/R中的x_y/R和o54RNA转录水平。不动杆菌ADPLPu」wx-:c;;/R在LB中28°C、150rpm振荡孵育。在LB培养基中加入间-二甲苯(500|aM),并且在4、8、14和22小时取样。进4亍三个重复。在每个时间点，才艮据厂商i兌明(QiagenTMRNA/DNA小试剂盒)从取出的1ml试样中4是取总细胞RNA。对于引物对xy/Rl一for-x少/R—rev和sigma54—for-sigma54_rev(表2),x少/R禾口a54的PCR产物用作DNA模板。x_y/R和a54的PCR产物用作才莫板并且分别标39记(Ambion7^司)。简单来i兌，将lpl的10mMEDTA加入到具有9fxlDNA产物(100ng4il)的PCR管中。3寻PCR管方文置于沸7jc浴中10min,然后通过干冰迅速冷却从而产生单链DNA4果针。随后在每个管中迅速加入1ja1补骨脂素-生物素，彻底混合，然后转移到96孑L板中，其^皮迅速转移到黑暗中。在365nmUV光下标记4果针45分钟。最后使用试剂盒(AmbionTM的非同位素标记试剂盒)4是供的方法来纯化探针，并且在-80。C冷冻器中储藏。BrightStar-PlusTM带正电尼龙膜(AmbionCo.)^皮用于斑点印记法(斑点杂交)。将每个样品的相同量的总RNA上样于膜上，并且在80。C固定15分钟。在膜已经预杂交30分钟后，通过在NorthemMaxTM杂交》爰沖、液(Ambion)中加入30ng/ml的变性探针并在42°C下孵育12-20小时来进行杂交。以2xSSC和0.5。/。SDS清洗杂交膜两次30分钟，然后才艮据厂商i兌明(BrightStarBioDetectTMAmbionCo.)冲企测。在黑暗中将该月莫方丈入到装有Kodak-牛学成{象月交片(scientificimagingfilm)(Kodak/>司)的盒中。该月交片曝光一'J、时，手工沖洗，并且在室温下干燥。结果和讨论4吏用前述的方法和材冲牛，通过在贝利不动4干菌ADP1的染色体中插入xy/R和pu-/wxCDABE来产生曱苯/二曱苯生物传感器。受体贝利不动^f菌ADP1细月包4妻受净果异源DNA并且通过同源重组将其整合到染色体中。贝利不动杆菌ADP1染色体上的s"/A启动子能够转录位于s"/A与s"/R之间的大的插入片段(insert)(>5.8kb)。表明s"/A与^/R的表达不受插入片段的存在的影响。携带插入片段的突变抹能够在SAA平板(plate)上生长，其中水杨酸盐用^f乍口眷一的碳源(Huangetal(2005)EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348)。在这个实施例中，Pu启动子净皮融合到pSalARjia:中从而产生质粒pSalAR—j)u—/wx(图1A,步骤1)。pSalAR_pu—/wx具有Pu-/wxCDABE侧翼的m/A和s"/R同源片,殳，其用作DNA供体。受体不动杆菌突变林ADPW67(其含有由于卡那霉素基因插入而被中断的s"/A)不能在SAA平^反上生长。在转化之后，通过与pSalAR_Pu_/"x同源重组，ADPW67的#皮中断的m/A基因#1恢复，转化林获得在SAA上生长的能力。同时，在不动杆菌ADPl一Pu一/w的m/A和m/R之间引入Pu-Zw;cCDABE(图1A,步骤2)。为了在染色体中引入xy/R，构建质粒pSalA—Km_x_y/R(图1A,步骤3),并且x_y/R_km侧翼连接s"/A的两个同源片段。使用PSalA_Km—x_y/R作为DNA供体，使用不动杆菌ADPl_pu—/wx作为受体来进行基因转化。通过在具有10|ig/mlKm的LB上生长来筛选转化林，并且命名为不动杆菌ADP1—Pu—/wx—xy/R(图1A,步骤4)。在"/R和Km基因之间引入Km插入片|殳(insert)的终止子，防止RNA聚合酶读过整个/wxCDABE而不激活Pu启动子。通过PCR和测序来确定不动杆菌插入片段的染色体结构响应于曱^/二甲苯的不动杆菌ADP1_pu_/wx_jcj;fll恶臭布i单胞菌(pp^,vfe)的TOL质粒的矽/R/Pu调节系统在异源宿主贝利不动杆菌ADP1中起作用。图IB示出当其被二曱苯气体(vapor)i秀导时，不动4干菌ADP1—Pu_/wx—;c少/R表现出强烈的生物发光，而未被诱导的细胞仍保持黑暗，显示了Pu-矽/R调节系统在宿主不动4干菌菌才朱ADP1—Pu—/wx—矽/R中的成功的转化和功負fe。也就是说，不动杆菌ADP1—Pu—/wx—x少/R可以被i人为是曱苯和二甲苯的生物传感器。已经发现大量的调节分解代谢途径的调节系统，它们的基因构成通常包4舌启动子和调节基因(CasesandLorenzo(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118;TropelandvanderMeer(2004)MicrobiologyandMolecularBiologyReviews68:474-)。贝禾ll不动才干菌ADP1可以没有困难地表达异源基因。41普通技术人员会i人识到，通过取4、启动子和调节基因，所描述4也细菌生物传感器。以这种方法，该系统可以:帔用于构建宽范围的可诱导的生物传感器。与其原始的宿主恶臭假单胞菌相似，不管诱导物是否存在，菌林ADP1—Pu_/mx—x_y/R中的Pu活性只在稳定阶段中^皮激活，证明为指凌史沉,默才莫式(图2)(CasesanddeLorenzo.(2001)EMBOJournal20:1-11and(2005)NatureReviewsMicrobiology3:105-118)。但是，这与以前报道的大肠杆菌(Escherichiacoli)系统形成对比，在大肠杆菌系统中，在细胞暴露于二甲苯之后不久Pu启动子即被诱导，不会经历指凄t沉,默(Willardsonetal(1998)AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:1006-1012)。与tod系纟克(Applegateetal(1998)AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:2730-2735)不同，在30小时的孵育之后，不动杆菌ADPl一Pu一/wx—xy/R的Pu启动子不能祐L苯酚、苯、萘、2-羟基苯曱酸(水杨酸)、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸盐或儿茶酚诱导。这表明Pu-w/R系统特异性地响应于曱苯、二曱苯或者它们的类似物。苯环的曱基对于诱导;^/R蛋白的正确构象(conformation)可能是重要的。不动杆菌ADP1—PuJwx一j^很的分解^R谢阻遏在它们的自然生境中，当多种碳源可用时，细菌优先利用有利的底物从而节省细胞新陈代谢。细菌通过碳源分解代谢阻遏(CCR)来实现这种调节。在某些(有利)碳源(一般是葡萄糖)的存在下，细菌会阻遏吸收其他的易分解性專交差的石友源所需要的才几制(BrucknerandTitgemeyer(2002)FemsMicrobiologyLetters209:141-148.)。先前的报道已经证实葡萄糖抑制假单胞菌(尸wwdowowoyw.)和大肠才干菌(五.co//.)的Pu活性(Casesetal(1999)JournalofBiologicalChemistry274:15562-15568)。在该研究中，不动杆菌ADPl—Pu—/mx—xy/R^皮接种于具有50mM葡萄糖或琥珀酸盐作为唯一碳源、以及曱苯、间-,对-或邻-二甲苯作为诱导物的基本培养基(MM)中。在该体系中，葡萄糖没有抑制Pu活性，而琥珀酸盐抑制了(图3A)。Case等显示破坏编码(磷酸转移酶系统(PTS)的)IIANtr蛋白的pstN,使恶臭假单胞菌丧失调节葡萄糖阻遏的能力。与假单胞菌和大肠杆菌相反，贝利不动杆菌ADPl不含葡萄糖转运磷酸转移酶系统。葡萄糖不能进入贝利不动杆菌ADPl的细胞质，只是在周质中氧化。葡萄糖吸收的这个特性可能造成在不动杆菌ADPl中葡萄糖不能对分解代谢阻遏做出响应(图3A)。这表明葡萄糖可能直接参与分解代谢阻遏。不动杆菌ADPl不编码6-磷酸葡萄糖脱氬酶或6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的基因。Velazquez等认为6-磷酸葡萄糖酸盐和/或2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖酸盐可能是恶臭假单胞菌中的Pu抑制的信号分子。在该研究中，特意向菌4朱ADPl_Pu—/wx一xj^R中加入6-石岸酸葡萄库唐酸钠盐没有影响Pu活性(数据未示出)。这个发现^提示6-磷酸葡萄糖酸盐单独不足以抑制Pu活性，它可能帮助缩小Pu抑制的信号分子的候选物。因为基因容易操作的优势，通过敲除基因和插入新的功能基因，贝利不动杆菌ADP1会使得能够鉴定介导Pu启动子调节的信号分子。不动杆菌ADP1和x_y/R/Pu原始宿主恶臭^f艮单力包菌的最适温度是30。C。在该研究中发现Pu启动子活性的最佳温度是28。C,其比在20、34或37°C下高2-54咅(图3B)。不动杆菌系统中的Pu/jcj很的转录调节在不同时间点通过RNA印迹法来检测不动杆菌菌才朱ADPl_Pu—/wx—xy/R中的"/R和a54mRNA水平(图4)。虽然，开始时在LB培养基中加入间-二甲苯，但Pu活性保持沉默直到细胞43进入稳定阶段(图4)。如同以前的^L察一样(Juradoetal(2003)JournalofBacteriology185:3379-3383:Ramosetal(1997)AnnualReviewofMicrobiology51:341-373),RNA印迹法i正实在生长阶^:中ADPl一Pu—/m:—x_y/R中的x;;/R的mRNA转录水平是组成性(或持续性)转录的(图4B)。但是，cr"的mRNA水平在不同的时间点不同。在8小时，生长曲线(图4A)显示细胞开始进入稳定阶^a，在这个时间点x_y/R的mRNA水平已经达到与14小时或者22小时时间点相同的水平(图4B)。与之不同，cr"转录水平和Pu活性与14小时或者22小时时间点相比相对4^f氐(图4B)。在14小时，a"的mRNA水平升高，Pu活性达到其最高水平(图4B)。这表明，如Cases等在恶臭假单胞菌宿主中发现的，表达、Pu活性和生长阶段之间存在直接联系(Casesetal(1996)MolecularMicrobiology19:7-17.)。实施例2-从水样品捕获编码调节蛋白的基因和启动子从而产生特定化合物的生物传感器的方法图6示意性示出了从水样品捕获编码调节蛋白的基因和启动子乂人而产生特定化合物的生物传感器的方法。首先，从7ml的地下7]C样品中提取总DNA从而提供大于10kb的DNA。从地下水样品中提取核酸的方法如下，该方法可以依比例调整从而适合使用的地下水的量。首先，50ml地下水经过0.22^im过滤器。然后该过滤器祐j丈置于BIO-101TM管(Q-biogeneTM)中。然后在管中加入1ml的DNA提取緩冲液，并且在65。C的水浴中孵育30min。DNA!是取纟爰沖液含有lOOmMTris—HC1[pH8.0]、100mMEDTA钠[pH8.0]、100mM磷酸盐緩冲液[pH8.0]、1.5MNaCl、1%CTAB和水。然后该管核:放置于Fast-prepTM珠磨式组织研磨器(beadbeater),于速度5.5进4亍30秒/人而石皮碎(或裂解，lyse)细胞。然后管在冰上冷却，并且以14,000rpm离心5分钟(冷冻)。提:取水相并且加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混合。该管以14,000rpm离心5分钟。^是耳又上层，通过加入0.6体积的异丙醇(或30%PEG6000/1.6MNaCl)并且充分混合来沉淀DNA。-使该管在实验台上于室温直立力文置1-2小时，然后14,000rpm离心10min。倒4卓上清夜，用200nl的70%乙醇清洗沉淀(pellet)。然后，该管再于14，000rpm离心10min,倒4卓乙醇，留下沉淀在真空装置中干燥或风干。将该沉淀重新悬浮在50(ilTE纟爰冲液或者水中。随后使用Sau3AI将从水中分离的DNA部分消化，并且连接到合适的捕获质粒(trappingplasmid)。4吏用两种捕获质粒。第一种质粒，命名为才喿纵子捕获体(operontrapper,OT)质粒，含有才艮告基因，被设计用于捕获启动子。第二种质粒，命名为调节子捕获体(regulatortrapper，RT)质粒，祐j殳计用于捕获编码调节蛋白的基因。两种质粒都含有贝利不动杆菌ADP1的同源DNA片段。宿主生物体优选是贝利不动杆菌ADP1,优选宿主菌林是AsalR突变林。在AsalR突变抹中，不动杆菌突变株的m/R基因被部分缺失，这4吏其不能在含有水杨酸盐作为唯一-友源的基本琼脂(MM)平氺反上生长(Huangetal.,(2005)AnalChem76，4452-4458)。Sau3Al消化的DNA浮皮克隆到OT或RT质粒中，然后通过将质粒转到大肠杆菌中来扩增质粒，或者更简z使地通过应用长PCR来扩增(图6B和6C)。为了将克隆的DNA整合到宿主生物体中，将质粒或PCR产物与不动杆菌菌抹AsalR的感受态细胞混合。整合需要两个步骤(1)通过水杨酸盐生长的恢复选择的潜在启动子整合；和(2)通过抗生素抗性如卡那霉素选择的潜在调节基因整合(图6D)。一旦整合到不动杆菌的染色体中，为编码调节蛋白的基因(其是来源于RT质粒的DNA)的DNA片段组成性地表达。OT质粒中的克隆的DNA此时被整合到可操作地连接到报告基因的不动杆菌染色体中。随后将具有两个整合的DNA序列的不动杆菌暴露于目标化合物。如果细胞含有调节蛋白和在调节蛋白和目标化合物的存在下被激活的启动子，则会表达报告基因。可以针对报告基因的表达(通过FACS(荧光活化细胞分拣器)用于GFP、或者通过菌落挑取仪用于/wx生物发光、或者通过X-Gal^r测用于lacZ)来筛选细胞。然后可以选择并分析任何表达报告基因的细胞。使用该方法，可以捕获编码调节蛋白的基因和相应的启动子，产生生物传感器。可以应用以下方法产生不动才干菌AsalR突变才朱，其中不动^干菌的s"/R基因的一部分已经被缺失，致使其不能在含有水杨酸盐作为唯一碳源的基本琼脂(MM)平板上生长(Huangetal.，2005.AnalChem76,4452-4458)。重叠延伸PCR(OEPCR)被用于产生具有所需的限制位点的AsalR融合(在Huangetal.,(2005)AnalChem76,4452-4458中描述了合适的方法)。然后AsalR融合体3皮克隆到pGEM-T载体(PromegaTM)/人而产生pAsalR。随后用BamHI来消^f匕pAsalR。用BamHI/人pRMJl切下的Km-SacB冲匡(Km-SacBcassette)(JonesandWilliams,AppliedandEnvironmentalMicrobiology69(9):5627-5635Sep2003)然后#L插入到pAsalR从而产生pAsalR—SacB—Km。然后，4要照Huangetal.(2005)AnalChem76,4452-4458中所描述的将pAsalR—SacB—Km转至不动杆菌ADPWH_/wx，并JU吏用含有10|ig/ml卡那霉素的LB来选4奪突变林。选择出的突变4朱命名为不动杆菌AsalR_SacB_Km。然后pAsalR转至不动扦菌AsalR—SacB—Km，并且使用具有50g/L蔗糖的LB筛选突变林，被筛选的突变抹被命名为不动杆菌AsalR。46实施例3-由从萘污染地点分离的DNA池生产与水杨酸盐反应的细菌生物传感器在本实施例中，质粒被用于从取自萘污染地点的样品中提取的DNA池捕获编码水杨酸盐调节基因的基因。然后可将该基因克隆到不动杆菌的突变抹的染色体中，其中salA启动子可操作地连接到报告基因从而产生水杨酸盐或萘的生物传感器。该实施例证明可以由/人环境才羊品回收的DNA;也中分离调节基因。构建不动杆菌AsalR突变林从环境样品分离水杨酸盐调节基因的第一步是产生不表达功能性水杨酸盐调节基因的不动杆菌ADP1突变林。这使用以下步骤来实现1.如前所述(Huangetal.,2005EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348)，^吏用重叠延伸PCR(OEPCR)来产生具有所需限制位点的AsalR融合；2.然后将AsalR基因克隆到pGEM-T载体中乂人而产生质粒pAsalR;3.然后用BamHI来消化质粒pAsalR;4.用BamHI,人pRMJl分离Km陽SacB才匡(cassette)(JonesandWilliams,2003AppliedandEnvironmentalMicrobiology69:5627-5635)然后克隆到pAsalR质粒乂人而产生pAsalR—SacB—Km;5.然后，如前所述将质粒pAsalR_SacB—Km转至不动杆菌ADPWH一/wx(Huangetal.,2005EnvironmentalMicrobiology7:1339-1348),并且使用含有10吗/mlKm的LB来筛选突变林。该突变才朱净皮命名为不动4干菌AsalR—SacB—Km。在不动#干菌ADPWH—/wx和不动杆菌AsalR_SacB_Km中，m/A基因可操作地连接到报告基因/wxCDABE;6.然后将pAsalR转至不动杆菌AsalR—SacB—Km，并且在具有50g/L蔗糖的LB上筛选阳性转化4朱，产生的突变4朱纟皮命名为不动杆菌AsalR。得到的菌林是^/R基因的突变林，但是携带了可操作地连接到/wx报告基因的m/A启动子。该菌4朱可以用于筛选编码水杨酸盐调节蛋白的基因。实际上，步骤1中对^/R基因进行的突变包括在s"/R基因中缺失4个石咸基，并且引入BglII限制酶位点，如下所示基因)CG----AGATCTCTACCGGGCATACTCAGGTC(缺失4bp并具有BglII位点的AsalR)在m/R基因中缺失4个石咸基造成石皮坏的水杨酸盐调节蛋白，其不能响应于水杨酸盐，因此不动杆菌的5""/A启动子不被激活，在水杨酸盐的存在下/wx基因不表达。在图10中示出了m/R基因的失活的效果。但是，如果在不动杆菌突变抹中存在起作用的m/R基因，那么在水杨酸盐的存在下，s"/R调节蛋白可以激活s"/A启动子并JU秀导可操作地连接到^/A启动子的报告基因的表达。在本实施例中，报告基因是生物发光基因/wxCDABE。通过使用生物传感器的生物发光，可以原位快速(一般少于15min)鉴定阳性克隆。GFP可替才灸地4皮才艮告，4旦是在可#皮才全测前，它需要更多的时间成熟(mature)。创建环境DNA的克隆文库在分离水杨酸盐调节的第二阶段是从环境样品获得DNA池。在这种情况中，从英国(UK)的萘污染地下水地点提取DNA池。使用实施例2中介绍的方法/人水中提取DNA。分离的DNA用Sau3AI部分消化，并克隆到"捕获质粒"pRK415中。然后通过电穿孔将pRK415转化到不动4干菌AsalR突变4朱中。pRK415能够在不动杆菌ADP1中复制并且可以表达任何克隆到其中的基因。通过涂布在添加了6lag/ml四环素和2mM水杨酸盐的LB上来筛选不动杆菌AsalR转化才朱。在可替换的实施方案中，克隆的DNA可在这个阶段被整合到宿主的染色体中，这可以通过引入与宿主染色体同源的侧翼序列来实现。筛选"捕获"xM^酸盐调节基因的转化林然后才艮据生物发光表达来筛选生长在添加了6(xg/ml四环素和2mM7jc杨酸盐的LB上的不动杆菌AsalR转化抹。理论是，能够在水杨酸盐的存在下显示生物发光，即能够激活可4喿作地连接到不动杆菌AsalR的/wx基因上的salA启动子的转化林必定表达m/A的调节蛋白。在本实施例中，调节蛋白由质粒表达。在产生的多于4000个转化抹中发现有3个生物发光阳性转化林。图11示出阳性转化林(转化抹A)的生物发光表达和阴性转化林(转化林B)没有生物发光。证明转化;昧A在水杨酸盐的存在下，发生生物发光，显示转化林A已经从环境样品提取的DNA池捕获了水杨酸盐调节基因，其能够补偿不动杆菌AsalR携带的^/R基因突变。没有任何的生物发光，证实突变株B(其是4000个阴性突变林之一)不能被水杨酸盐激活，显示转化抹B没有携带捕获的水杨酸盐调节基因。质粒提取和DNA测序为了证实转化林A,以及实际上另外两个阳性转化林，已经捕获了水杨酸盐调节基因，使用煮沸裂解法来从三个生物发光阳性转化林提取pRK415捕获质粒(Sambrooketal.,1989M/簡/arc/画'"g:"/"Zor",o^yw"ww"/:ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y)。图12中示出了琼脂糖凝胶上跑出的提取的质粒DNA样品。提取的质粒的测序可以被用于证实被克隆的基因确实是水杨酸盐调节基因。总之，本实,睑证明不动杆菌ADP1的突变4朱可以被成功地用于从环境样品捕获基因。在本实施例中，使用基于质粒的系统捕荻/克隆了由水杨酸盐激活的调节基因，4旦是可以用相同的原理来克隆其他的调节基因，和/或克隆感兴趣的启动子。一旦纟皮捕获，调节基因和/或感兴趣的启动子可以^皮整合到不动杆菌的染色体DNA中从而产生生物传感器。在本实施例中，捕获的调节基因可以^皮整合到不动杆菌AsalR的染色体中(如前所述)乂人而取4戈突变的salR基因，伊乙选^皮:没计为其^L成性:l也表达/人而产生用于4企测水杨酸盐的生物传感器。权利要求1.一种生产用于特定化合物的生物传感器的方法，包括(a)鉴定所述特定化合物；(b)获得DNA池；(c)将来自所述DNA池的DNA片段克隆到一种或两种质粒中的第一和第二位点；(d)将所述克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，其中来自所述质粒中的所述第一位点的DNA在第一位置被整合到所述染色体中，使得它将在所述宿主生物体中被表达，并且来自所述质粒中的所述第二位点的DNA在第二位置被整合到所述染色体中，使得所述克隆的DNA被可操作地连接至报告基因；(e)将所述特定化合物施加至所述宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行筛选。2.—种鉴定(i)编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因和(ii)由所述调节蛋白和所述特定化合物激活的启动子的方法(a)鉴定所述特定化合物；(b)获得DNA池；(c)将来自所述DNA池的DNA片4殳克隆到一种或两种质粒中的第一和第二位点，使得当所述质粒净皮转化到宿主生物体中时在所述第一位点的DNA将被表达，并且在所述第二位点的DNA被可操作地连接至报告基因；(d)用所述一种或两种质粒转化宿主生物体；(e)将所述特定化合物施加至所述寿争4b的宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行筛选。3.—种鉴定编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因的方法，包括(a)鉴定特定化合物；(b)获得DNA池；(c)将来自所述DNA池的DNA片革殳克隆到质粒中；(d)将所述克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，寸吏得所述克隆的DNA将在所述宿主生物体中^皮表达，其中所述染色体已经携带可操作地连接至报告基因的启动子，并且其中已知所述启动子在所述特定化合物和未知调节蛋白的存在下#1激活；(e)将所述特定化合物施加至所述宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行篩选。4.一种鉴定编码响应于特定^:合物的调节蛋白的基因的方法，包括(a)鉴定所述特定化合物；(b)获得DNA片段池；(c)将来自所述DNA池的DNA片段克隆到质粒中，使得当所述质粒被转化到宿主生物体中时，所述克隆的DNA将被表达；(d)用含有所述克隆的DNA的所述质4立转化宿主生物体，其中所述宿主生物体携带可操作地连接至报告基因的启动子，并且其中已知所述启动子在所述特定化合物和未知调节蛋白的存在下^皮激活；(e)将所述特定化合物施加至所述转化的宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行筛选。5.一种鉴定由响应于特定化合物的调节蛋白激活的启动子的方法，包4舌(a)鉴定特定化合物；(b)获得DNA池；(c)将来自所述DNA池的DNA片,爻克隆到质粒中；(d)将所述克隆的DNA整合到宿主生物体的染色体中，《吏得所述克隆的DNA^皮可4喿作地连"I妄至才艮告基因，其中所述因；'-；、'、。工、、(e)将所述特定化合物施加至所述宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行筛选。6.一种鉴定由响应于特定化合物的调节蛋白激活的启动子的方法，包括(a)鉴定所述特定化合物；(b)获得DNA片段池；(c)将来自所述DNA池的DNA片,殳克隆到质粒中，使得所述克隆的DNA^皮可才喿作地连4妄至净艮告基因；(d)用含有所述克隆的DNA的所述质4立转化宿主生物体，其中所述宿主生物体携带编码响应于所述特定化合物的调节蛋白的基因；(e)将所述特定化合物施加至所述转化的宿主生物体；和(f)对所述报告基因的表达进行筛选。7.—种生产用于检测特定化合物的生物传感器的方法，包括(a)将编码响应于所述特定化合物的调节蛋白的基因克隆到第一质粒中的第一位置；(b)将在所述调节蛋白和所述特定化合物存在下被激活的启动子克隆到所述第一质粒中的第二位置或第二质粒中；(c)将编码所述调节蛋白的所述克隆的基因和所述克隆的启动子整合到宿主生物体的染色体中，其中所述启动子可操作地连4妄至用于4企测所述启动子的激活的元件。8.—种生产生物传感器的方法，包4舌将通过4又利要求2、4或6中任一项所述的方法鉴定的基因和/或启动子整合到宿主生物体的染色体中的步骤。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述特定化合物是环境致污物或污染物。10.根据权利要求1至6或8中任一项所述的方法，其中通过从被所述特定化合物污染的样品中分离DNA而获得所述DNA池。11.根据权利要求1至6、8或9中任一项所述的方法，其中从土:泉、地下水、任何水体、空气、人或非人机体或体液的样品，或任何其他合适的样品获得所述DNA池。12.4艮据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述克隆的DNA一皮整合到所述宿主生物体的染色体中，其中所述DNA直4妄/人一种或多种质粒被整合到所述染色体中，或者它通过PCR被扩增且所述PCR片賴j皮整合到所述染色体中。13.根据权利要求12所述的方法，其中通过同源重组将所述克隆的序列整合到所述宿主生物体的染色体中。14.根据权利要求l、2或7所述的方法，其中在所述第一位置整合到所述宿主染色体中或所述质并立中的所述第二位点的DNA^皮i殳计成在所述宿主生物体中组成性地表达。15.根据权利要求l、2或7所述的方法，其中在所述第二位置整合到所述宿主染色体中或所述质粒中的所述第二位点的DNA被设计成可操作地连接至报告基因进行定位。16.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述克隆的DNA在所述宿主生物体中组成性地表达。17.根据权利要求5或6所述的方法，其中至少在试验条件下，编码所述调节蛋白的所述基因在所述宿主生物体中组成性地表达。18.才艮据前述任一项4又利要求所述的方法，其中编码所述调节蛋白的所述基因、和/或所述启动子，对于所述宿主生物体是异源的。19.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物选自包括芳香族溶剂、氯化化合物、硝酸盐和来自农业径流的杀虫剂、燃料、溶剂、推进剂、杀虫剂的成分，以及这些化合物的任何降解产物或它们的组合的组。20.根据权利要求1或8所述的方法，其中所述生物传感器只检测生物可利用的化合物。21.才艮据前述任一项4又利要求所述的方法，其中所述宿主生物体具有大于10—6的感受性。22.才艮据前述任一项纟又利要求所述的方法，其中所述宿主生物体显示约0.1%的整合率。23.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述宿主生物体是不动杆菌物种或假单胞菌物种的细菌，或任何其他的y细菌物种的细菌。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主生物体是贝利不动杆菌。25.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中用于检测所述启动子的激活的元件或所述报告基因是表达(3-半乳糖苷酶的基因，或是一种或多种萤火虫荧光素酶基因，或是绿色荧光蛋白(GFP)基因。26.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述克隆的启动子和/或编码所述调节蛋白的所述克隆的基因源自生物体代谢所述特定化合物所使用的操纵子。27.根据权利要求l、7或8所述的方法，其生产能够检测纳摩尔水平的特定4b合物的生物传感器。28.—种才企测样品中是否存在特定化合物的方法，包括(a)使根据权利要求1、7或8中任一项所述的方法制得的生物传感器接触所述样品；(b)观察所述报告基因的表达/所述用于4企测所迷启动子的激活的元件的表达在所述生物传感器中是否升高。29.—种用于检测样品中的化合物的试剂盒，包含根据权利要求1至8中4壬一项所述的方法制得的生物传感器和4吏用所述生物传感器的说明书。30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述生物传感器设置在容器中，所述容器将释放所述生物传感器到环境中的机会降到最低。31.—种用于生产生物传感器的试剂盒，包含具有两个克隆位点的一种或两种质粒，每个质粒上一个位点或一个质粒上两个^f立点，以及利用权利要求1至27中任一项所述的方法的说明书。32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括宿主生物体。33.利用4又利要求1至27中任一项所述的方法生产的生物传感器。全文摘要本发明涉及用于生产用来检测特定化合物的生物传感器、用于鉴定编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因以及用于鉴定编码响应于特定化合物的调节蛋白的基因的新方法。文档编号C12N15/09GK101605888SQ200780049145公开日2009年12月16日申请日期2007年11月7日优先权日2006年11月7日发明者安德鲁·怀特利,巍黄申请人:自然环境研究委员会