供氧降解地下水中氯代烃的菌剂及应用
【专利摘要】本申请涉及一种以H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂及其培养方法和应用。它的活性成份为小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)CGMCC1.8739、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)CGMCC1.1788和热带根瘤菌(Rhizobium tropici)CGMCC 1.2540，其按重量份数计比例为1:1:1，增殖后进行H2O2和三氯乙烯(TCE)定向培养后得到的菌剂，混合菌剂不仅对供氧剂H2O2有较强的耐受能力，并且对三氯乙烯(TCE)有很强的降解能力。
【专利说明】
一种H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂及应用
技术领域
[0001]本发明涉及采用生物法治理地下水污染领域技术，更具体地讲，涉及一种以H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂及其应用。
【背景技术】
[0002]氯代烃是一种常见的氯代有机溶剂，被广泛地用作化工原料和清洗剂，对其不合理的处理和处置会使其进入到环境中，大部分的氯代烃先污染土壤层，然后慢慢释放到地下水中，造成了严重的地下水环境污染。同时，氯代烃具有较高毒性，会对生态环境和人体健康构成极大的威胁。氯代烃在地下水中的污染现状已经引起了广泛关注，研究人员都致力于修复这种污染。
[0003]目前地下水污染治理与修复的方法主要有物理法、化学法以及生物法。与传统的物理化学处理方法相比，微生物修复技术由于便捷、经济、高效而被广泛应用于地下水氯代烃原位处理中。厌氧降解的脱氯不彻底性，且降解的中间产物具有更高毒性，致使好氧代谢氯代烃成为目前的热点研究内容。然而地下水环境中氧气的浓度很低，好氧微生物无法在此环境中存活，更不用说它们降解氯代烃的能力。因此近年来探索出许多为地下水环境进行供氧的方法。由于过氧化氢具有价格低廉、无二次污染等优点，使之成为生物修复中较普遍的供氧方案。
[0004]很多场地试验中将高效降解菌株投加入受氯代烃污染的土壤或是地下水中进行原位生物修复。厌氧降解脱氯不彻底，且降解的中间产物具有更高毒性，降解速度也十分缓慢。好氧降解可以将TCE氧化为环氧化物，环氧化物不稳定，会最终分解为Cl—、C02和一些小分子，降解彻底，是目前的热点研究内容。但是好氧菌株由于受环境氧浓度的限制，往往不能发挥作用。因此可以在地下水环境中，使好氧优势微生物利用H2O2释放出的氧气来发挥其降解氯代烃的能力，但是作为供氧剂的过氧化氢具有很强的毒性，会抑制微生物正常的生长代谢，影响好氧微生物修复的效果。因此，开发出耐受H2O2并能降解氯代烃的高效降解菌剂对于治理和修复地下水中的氯代烃污染具有很重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种以H2O2供氧来降解地下水中氯代烃的菌剂。本发明所提供的用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂，它的活性成份为小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是，提供利用上述以H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂在降解三氯乙烯(TCE)方面的应用。本发明的微生物菌剂可与H2O2—起注入受TCE污染的地下水中，并在H2O2作为氧源的条件下对地下水中的TCE进行高效降解。
[0007]本发明所述用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂通过诱导过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，S0D)和过氧化物酶(Peroxidase，P0D)来分解H2O2并解除毒性，对供氧剂H2O2有较强的耐受能力。
[0008]菌剂的活性成份为小麦苍白杆菌CGMCC1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540，菌剂培养过程中小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:1:1进行培养得到。
[0009]培养本发明菌剂的方法包括如下步骤:
[0010](I)所述小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:1:1在培养基中30_35°C培养60-80小时进行增殖培养得到菌液，所述培养基为蛋白胨8-12g、酵母提取物3.5-6.0g、葡萄糖0.8-1.2g，超纯水加至I OOOmUpH值6.5-7.5，培养基经110_130°C高压灭菌10-30分钟后接种三种菌；
[0011](2)在血清瓶中加入5-10mL步骤(I)得到的菌液、50_70mL无机盐培养基和450-550yL微量元素，另外在血清瓶中加入三氯乙烯(TCE)并使其浓度为5-15mg/L进行定向培养，然后迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-130rmp的培养箱中振荡培养，定期进行转接，转接过程中逐步提高三氯乙稀(TCE)浓度至80-120mg/L，定向培养过程持续50-60天，三氯乙烯(TCE)耐受度达到90_120mg/L ；
[0012](3)在另一血清瓶中加入65-80mL无机盐培养基，灭菌后加入15-25mL步骤(2)得到的菌液，持续通入犯，吹去瓶中溶解氧，迅速加入浓度为80mg/L的三氯乙烯(TCE)，然后加入H2O2储备液，使H2O2终浓度为1.5-3.0mM，迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-120rmp的培养箱中振荡培养，定期进行转接，转接过程中逐步提高H2O2浓度至7-9mM，三氯乙烯(TCE)浓度维持80mg/L不变，定向培养35-60天，H2O2耐受度达到7-9mM，且延迟期大大缩短。
[0013]步骤(2)中所述无机盐培养基为0.024g/L Ca(NO3)2.4H20、0.246g/L、MgS〇4.7H20、7.0g/L Na2P04、3.0g/L KH2PO4和2.52g/L(NH4)2HP04，所述微量元素为0.3g/L HBO3、0.07g/L ZnCl2、0.024g/L NaMoO4.2H20、0.006g/L MnCl2.4H20、0.75g/L NiCl2.6H2O和0.19g/L CoCl2.6H2O0
[0014]步骤(3)中所述无机盐培养基为0.024g/L Ca(NO3)2.4H20、0.246g/L MgSO4.7H20、7.0g/L Na2P04、3.0g/L KH2PO4和2.52g/L(NH4)2HP〇4。
[0015]本发明菌剂在治理和修复氯代烃污染地下水中的应用，该菌剂采用H2O2供氧的条件下用于降解地下水中的氯代烃，菌剂与H2O2—起注入受三氯乙烯(TCE)污染的地下水中，并在H2O2作为氧源的条件下对地下水中的三氯乙烯(TCE)进行降解。
[0016]本发明所述用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂，能在厌氧条件下以8mmol/LH2O2供氧，在15天内将无机盐培养基中120mg/L的TCE降解85 %以上。TCE降解率定义为:(TCE空白组浓度-TCE实验组浓度)/TCE空白组浓度X 100 %。
[0017]本发明所述用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂，其对TCE的耐受浓度范围为0-120mg/L左右，且不超过150mg/L ；最佳pH值为7.0左右;选择10 %的接种量较为合适。
[0018]本发明所述混合菌剂的优点在于:(I)菌剂对供氧剂H2O2有较强的耐受能力；(2)该菌剂对TCE有很强的降解能力；(3)该菌剂可将TCE彻底降解为无毒无害产物；(4)该菌剂实施起来较为方便，对有机物污染的地下水具有高效、经济的特点。因此对于地下水环境中的氯代烃原位生物修复具有重要的研究优势和广阔的应用前景。
[0019]本发明中所用菌种均来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCCJft 址:北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，邮编:100101)。
【具体实施方式】
[0020]实施例1、用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂的制备包括如下步骤:
[0021](I)所述小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:1:1在培养基中30_35°C培养60-80小时进行增殖培养得到菌液，所述培养基为蛋白胨8-12g、酵母提取物3.5-6.0g、葡萄糖0.8-1.2g，超纯水加至I OOOmUpH值6.5-7.5，培养基经110_130°C高压灭菌10-30分钟后接种三种菌；
[0022](2)在血清瓶中加入5-1 OmL步骤(I)得到的菌液、50_70mL无机盐培养基(0.024g.L-1Ca(NO3)2.4H20；0.246g.L-1MgSO4.7H20；7.0g.L-1Na2PO4;3.0g.L_1KH2P04;2.52g.L-1(NH4)2HP04)，和450-550yL微量元素(0.3g/L HB03、0.07g/L ZnCl2、0.024g/L NaMoO4.2H20、0.006g/L MnCl2.4H20、0.75g/L NiCl2.6H2O和0.19g/L CoCl2.6H2O)，另外在血清瓶中加入三氯乙烯(TCE)并使其浓度为5-15mg/L进行定向培养，然后迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35 0C、110-130rmp的培养箱中振荡培养，以5-6天为一个定向培养周期，一个定向培养周期后，取5-10mL定向培养后的菌液转接至设定TCE浓度的新鲜液体培养基中，定期进行转接，转接过程中逐步提高三氯乙烯(TCE)浓度至80-120mg/L，定向培养过程持续50-60天，三氯乙烯(TCE)耐受度达到90-120mg/L；
[0023](3)在另一血清瓶中加入65-80mL无机盐培养基(0.024g.L-1Ca(NO3)2.4H20；0.246g.L-1MgSO4.7H20；7.0g.L-1Na2PO4;3.0g.L-lKH2P04；2.52g.L-1(NH4)2HPO4)
菌后加入15 - 2 5 m L步骤(2)得到的菌液，持续通入N 2，吹去瓶中溶解氧，迅速加入浓度为80mg/L的三氯乙烯(TCE)，然后加入H2O2储备液，使H2O2终浓度为1.5-3.0mM，迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-120rmp的培养箱中振荡培养，以5-6天为一个定向培养周期，一个定向培养周期后，取5-10mL定向培养后的菌液转接至设定H2O2浓度的新鲜液体培养基中，定期进行转接，转接过程中逐步提高H2O2浓度至7-9mM，三氯乙烯(TCE)浓度维持80mg/L不变，定向培养35-60天，H2O2耐受度达到7_9mM，且延迟期大大缩短。
[0024]富集菌群能在厌氧条件下以8mmol/LH2O2供氧，在15天内将无机盐培养基中120mg/L的TCE降解85%以上。TCE降解率定义为:(TCE空白组浓度-TCE实验组浓度)/TCE空白组浓度X 100%。
[0025]实施例2、用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂的制备
[0026]包括如下步骤:
[0027](I)所述小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:2: 2在培养基中30_35°C培养60-80小时进行增殖培养得到菌液，所述培养基为蛋白胨8-12g、酵母提取物3.5-6.0g、葡萄糖0.8-1.2g，超纯水加至I OOOmUpH值6.5-7.5，培养基经110_130°C高压灭菌10-30分钟后接种三种菌；
[0028](2)在血清瓶中加入5-10mL步骤(I)得到的菌液、50_70mL无机盐培养基(0.024g.L-1Ca(NO3)2.4H20；0.246g.L-1MgSO4.7H20；7.0g.L-1Na2PO4;3.0g.L_1KH2P04;2.52g.L-1(NH4)2HP04)，和450-550yL微量元素(0.3g/L HB03、0.07g/L ZnCl2、0.024g/L NaMoO4.2H20、0.006g/L MnCl2.4H20、0.75g/L NiCl2.6H2O和0.19g/L CoCl2.6H2O)，另外在血清瓶中加入三氯乙烯(TCE)并使其浓度为5-15mg/L进行定向培养，然后迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35 0C、110-130rmp的培养箱中振荡培养，以5-6天为一个定向培养周期，一个定向培养周期后，取5-10mL定向培养后的菌液转接至设定TCE浓度的新鲜液体培养基中，定期进行转接，转接过程中逐步提高三氯乙烯(TCE)浓度至80-120mg/L，定向培养过程持续50-60天，三氯乙烯(TCE)耐受度达到90-120mg/L；
[0029](3)在另一血清瓶中加入65-80mL无机盐培养基(0.024g.L-1Ca(NO3)2.4H20；0.246g.L-1MgSO4.7H20；7.0g.L-1Na2PO4;3.0g.L-lKH2P04；2.52g.L-1(NH4)2HPO4)
菌后加入15 - 2 5 m L步骤(2)得到的菌液，持续通入N 2，吹去瓶中溶解氧，迅速加入浓度为80mg/L的三氯乙烯(TCE)，然后加入H2O2储备液，使H2O2终浓度为1.5-3.0mM，迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-120rmp的培养箱中振荡培养，以5-6天为一个定向培养周期，一个定向培养周期后，取5-10mL定向培养后的菌液转接至设定H2O2浓度的新鲜液体培养基中，定期进行转接，转接过程中逐步提高H2O2浓度至7-9mM，三氯乙烯(TCE)浓度维持80mg/L不变，定向培养35-60天，H2O2耐受度达到7_9mM，且延迟期大大缩短。
[0030]富集菌群能在厌氧条件下以8mmol/LH2O2供氧，在15天内将无机盐培养基中120mg/L的TCE降解85%以上。TCE降解率定义为:(TCE空白组浓度-TCE实验组浓度)/TCE空白组浓度X 100%。
[0031 ]实施例3.实施例1和实施例2在H2O2供氧条件下降解TCE的应用
[0032]所述菌剂在治理和修复氯代烃污染地下水中的应用，其特征在于，该菌剂采用H2O2供氧的条件下用于降解地下水的氯代烃。本发明的微生物菌剂可与H2O2—起注入受TCE污染的地下水中，并在H2O2作为氧源的条件下对地下水中的TCE进行高效降解。
[0033]实施例4.实施例1和实施例2的菌剂抗氧化能力测定
[0034]测定用于H2O2供氧降解地下水中氯代烃的菌剂中的过氧化氢酶活、超氧化物歧化酶活和过氧化物酶活。
[0035]过氧化氢酶活性采用紫外速率直接法测定过氧化氢酶活性。在测定管中加入2.8mL 15mmol/L H2O2和0.2mL酶液，空白管中以蒸馏水代替15mmol/L H202。紫外分光光度计进行测定，空白管进行调零，240nm下测定30s内吸光度的变化率。
[0036]超氧化物歧化酶活性测定采用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒进行测定。
[0037]过氧化物酶活性测定方法如下:空白管中加入反应混合液3mL，磷酸缓冲液(pH=7.8) ImL，作为校零对照，测定管中加入反应混合液3mL，酶液lmL，于470nm处测定OD值，计算45s内吸光度的变化率。
[0038]测定结果表明，该菌剂的过氧化氢酶活性达3.73U/每毫克蛋白质，超氧化物歧化酶活性达0.92U/每毫克蛋白质，过氧化物酶活性达0.14U/每毫克蛋白质。
[0039]通过测定菌剂的抗氧化酶活性，发现菌剂主要通过诱导过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(Peroxidase，P0D)来分解H2O2并解除毒性。
[0040]上述实验结果说明该菌剂能有效的分解H2O2生成氧气，而且能降低H2O2及02—对菌体本身的毒性，为好氧生物降解提供条件。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种适用于H2O2供氧以降解地下水中氯代烃的菌剂，其特征在于:菌剂的活性成份为小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC1.2540，菌剂培养过程中小麦苍白杆菌CGMCC 1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:1:1进行培养得到。2.一种培养权利要求1所述菌剂的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)所述小麦苍白杆菌CGMCC1.8739，嗜麦芽糖寡养单胞菌CGMCC 1.1788和热带根瘤菌CGMCC 1.2540按重量份数计比例为1:1:1在培养基中30_35°C培养60-80小时进行增殖培养得到菌液，所述培养基为蛋白胨8-12g、酵母提取物3.5-6.0g、葡萄糖0.8-1.2g，超纯水加至100mUpH值6.5-7.5，培养基经110_130°C高压灭菌10-30分钟后接种三种菌； (2)在血清瓶中加入5-10mL步骤(I)得到的菌液、50_70mL无机盐培养基和450_550yL微量元素，另外在血清瓶中加入三氯乙烯(TCE)并使其浓度为5-15mg/L进行定向培养，然后迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-130rmp的培养箱中振荡培养，定期进行转接，转接过程中逐步提高三氯乙稀(TCE)浓度至80-120mg/L，定向培养过程持续50-60天，三氯乙烯(TCE)耐受度达到90_120mg/L ； (3)在另一血清瓶中加入65-80mL无机盐培养基，灭菌后加入15-25mL步骤(2)得到的菌液，持续通入N2,吹去瓶中溶解氧，迅速加入浓度为80mg/L的三氯乙烯(TCE)，然后加入H2O2储备液，使H2O2终浓度为1.5-3.0mM，迅速用匹配的丁基橡胶塞和铝盖将瓶子塞紧以尽量减少挥发，培养瓶置于25-35°C、110-120rmp的培养箱中振荡培养，定期进行转接，转接过程中逐步提高H2O2浓度至7-9mM，三氯乙烯(TCE)浓度维持80mg/L不变，定向培养35-60天，H2O2耐受度达到7-9mM，且延迟期大大缩短。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(2)中所述无机盐培养基为0.024g/LCa(NO3)2.4H20、0.246g/L MgSO4.7H20、7.0g/LNa2P04、3.0g/L KH2PO4和 2.52g/L(NH4)2HPO4，所述微量元素为 0.3g/LHB03、0.07g/L ZnCl2、0.024g/L NaMoO4.2H20、0.006g/LMnCl2.4H20、0.75g/L NiCl2.6H2O和0.19g/L CoCl2.6H2O。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(3)中所述无机盐培养基为0.024g/LCa(NO3)2.4H20、0.246g/L MgSO4.7H20、7.0g/LNa2P04、3.0g/L KH2PO4和 2.52g/L(NH4)2HPO4。5.—种权利要求2-4所述培养方法培养得到的菌剂在治理和修复氯代烃污染地下水中的应用，其特征在于，该菌剂采用H2O2供氧的条件下用于降解地下水中的氯代烃，菌剂与H2O2—起注入受三氯乙烯(TCE)污染的地下水中，并在H2O2作为氧源的条件下对地下水中的三氯乙烯(TCE)进行降解。
【文档编号】C12R1/41GK105820978SQ201610254805
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】李辉, 刘勇弟, 王晓丽, 陈帅, 张施阳, 周阳
【申请人】华东理工大学