本发明涉及微生物的环境修复领域，具体的，涉及一株具有二氯喹啉酸降解功能的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，含有该脱氮假单胞菌的菌剂，以及它们在降解二氯喹啉酸中的应用。
背景技术：
二氯喹啉酸(Quinclorac)是德国巴斯夫公司上世纪80年代开始推广的一种激素型喹啉酸类水田除草剂，尤其对于防除稻田稗草具有良好的除草效果，但具有较长的残留期。它的化学名称为3,7-二氯喹啉-8-羧酸，分子式为C10H5Cl2NO2，分子量为942.1Da，商品名为克稗星、快杀稗、神锄、稗草净、杀稗灵、稗草王等。它的作用靶标为植物体内的合成激素，通过干扰植物激素调节酶活性，使生物体生长、代谢不能正常进行，出现叶片变小、扭曲、颜色加深的现象，从而使它们的生物量减少，严重者致植物枯萎坏死，甚至整株死亡，来实现除草的目的。
由于一些用户对二氯喹啉酸的除草特性缺乏足够认识，盲目应用和增大剂量，从而导致土壤残留，并对下茬作物产生药害。二氯喹啉酸施用后30天内除水稻外将不能种植任何作物，1年之内不能种烟草、茄子，2年内不能种番茄、胡萝卜。此外，芹菜、香菜等伞形花科作物对二氯喹啉酸十分敏感，不可用施过二氯喹啉酸的水浇灌。其中，二氯喹啉酸对烟草的致畸症状最为明显，主要发生在烟稻轮作地区，且呈整田大片发生。因此，土壤中以二氯喹啉酸为主的农残对于烟草的生长与品质有不良影响，会给烟叶生产带来严重的经济损失。
目前针对土壤中的农残问题的传统治理方法主要有换土，淋洗，化学钝 化法，电修复，热修复等物理方法与化学方法，但总体而言，这些技术都具有一定局限性，实施成本很高，并且对土壤破坏严重，易带来其他污染。
因此，亟需开发一种成本较低的，不会对土壤造成破坏且不会带来二次污染的对残留二氯喹啉酸药进行降解的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一株脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，以降解效果显著、操作简单、价格低廉且环境友好的方式对二氯喹啉酸进行降解。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，其中，所述脱氮假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10845，命名为W-7。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)。
第三方面，本发明提供了如上所述的脱氮假单胞菌和/或菌剂在降解二氯喹啉酸中的应用。
第四方面，本发明提供了一种降解二氯喹啉酸的方法，该方法包括：将如上所述的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，和/或如上所述的菌剂与含有二氯喹啉酸的环境接触，以对环境中的二氯喹啉酸进行降解。
优选的，该方法还包括，在对所述二氯喹啉酸降解的过程中，向所述含有二氯喹啉酸的环境中添加无机盐。更优选的，所述无机盐为KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，MgSO4，CaCl2和FeSO4。
本发明提供的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)具有如下的优点：(1)只需提供无机盐培养基即可在含二氯喹啉酸的培养环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，也即，本发明提供的脱氮假单胞菌 能够在二氯喹啉酸为唯一碳源的环境中进行生长；(2)在制备时只需将保藏菌种活化，操作简单，成本低廉；(3)在水体和土壤中都有很高的降解效果，在水体中二氯喹啉酸含量为200mg/L的情况下，所述细菌培养24h，降解率高达93.4％。在土壤中，在二氯喹啉酸含量为20mg/Kg的情况下，所述细菌降解率也能达到88.0％。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的菌株被命名为脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10845，命名为W-7。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一株脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，其中，所述脱氮假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10845。
本发明的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)分离自安徽宣城被二氯喹啉酸污染的烟植土壤。
所述分离筛选的方法可以为本领域常规分离新菌株的方法。具体到本申请，例如可以包括：取采自安徽宣城二氯喹啉酸污染的土壤，溶于含二氯喹啉酸的无机盐培养基中，25-37℃振荡箱(130-170r/min)培养6-10h，然后静置取上清。用10倍稀释法，将上清液稀释为7个浓度梯度，在含二氯喹 啉酸的LB固体培养基上涂布，25-37℃培养72h后，挑取单菌落，多次划线，做进一步的纯化，从而得到了本发明的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)。
其中，所述无机盐培养基可以以重量比含有KH2PO4(0.8-1.2％)，K2HPO4(0.8-1.2％)，NH4NO3(1-1.5％)，MgSO4(0.03-0.08％)，CaCl2(0.001-0.003％)，FeSO4·7H2O(0.01-0.03％)，pH可以为6.0-7.5。
本发明提供的脱氮假单胞菌经过培养能够产生大量脱氮假单胞菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述脱氮假单胞菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将脱氮假单胞菌的活菌体接种于LB培养基中，并且在好氧条件下，在25-37℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。另外，如上所述的，本发明提供的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)还可以在含有二氯喹啉酸或其它细菌常规利用的氮源的如上无机盐培养基中进行生长。
本发明可以进一步分离上述培养液中的脱氮假单胞菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
本发明提供的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)。
优选的，该菌剂含有如上所述的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)的活细胞。
根据本发明，在所述菌剂中，所述脱氮假单胞菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
另外，根据预定用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的不会对所述脱氮假单胞菌的活性造成影响的赋形剂等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知，本发明在此不再详细赘述。
第三方面，本发明还提供了如上所述的脱氮假单胞菌和/或如上所述的菌剂在降解二氯喹啉酸中的应用。
本发明提供的脱氮假单胞菌在只需要存在碳源、氮源和无机盐的条件下，且可在二氯喹啉酸为唯一碳源的培养环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对二氯喹啉酸有很高的耐受性与降解能力。
第四方面，本发明提供了一种降解二氯喹啉酸的方法，该方法包括：将如上所述的脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，或如上所述的菌剂与含有二氯喹啉酸的环境接触，以对环境中的二氯喹啉酸进行降解。
根据本发明，优选的，在脱氮假单胞菌能够存活的条件下，将其与含有二氯喹啉酸的环境接触。术语“脱氮假单胞菌能够存活”是指在含有二氯喹啉酸的环境中，至少大约20％，优选至少大于40％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“脱氮假单胞菌能够存活的条件”是指至少包括碳源、氮源和无机盐的能够维持菌体生命力的条件。
根据本发明，所述含有二氯喹啉酸污染的环境可以包括任何含有二氯喹啉酸的环境，例如，所述含有二氯喹啉酸污染的环境可以包括含有二氯喹啉酸的土壤或水体。
根据本发明，接种至所述含有二氯喹啉酸污染的环境中的脱氮假单胞菌的形式并没有特别的限定，只要保证接种后所述脱氮假单胞菌能够在所述含有二氯喹啉酸污染的环境中起作用并且对所述二氯喹啉酸有效地降解即可，接种的所述脱氮假单胞菌的形式，例如，可以为培养至对数期的活化菌体，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，优选为培养至对数期的活化菌体。
本发明对接种的脱氮假单胞菌数量也没有特别的限制，这可以根据所述 含有二氯喹啉酸污染的环境中的二氯喹啉酸的含量以及菌株在所述环境中的生存能力来决定，例如，当所述环境中的二氯喹啉酸含量较高或所述环境对于所述脱氮假单胞菌的生存较不利时，可以提高所述脱氮假单胞菌的接种量；当所述环境中的二氯喹啉酸含量较低或所述环境对所述脱氮假单胞菌的生存影响较小时，可以减少所述脱氮假单胞菌的接种量。
根据本发明，为了进一步提高本发明提供的脱氮假单胞菌在含有二氯喹啉酸污染的环境中的生存能力以及活性，本发明的方法还包括向所述环境中提供额外的无机盐。
其中，所述额外的无机盐的种类可以为本领域公知的用于培养脱氮假单胞菌的无机盐的种类。优选的，所述无机盐为KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，MgSO4，CaCl2和FeSO4中的一种或多种，更优选为KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，MgSO4，CaCl2和FeSO4。
其中，本发明对加入的所述无机盐的量没有特别的限制，可以根据所述含有二氯喹啉酸污染的环境中无机盐的种类以及含量而定。例如，以KH2PO4(0.8-1.2重量％)，K2HPO4(0.8-1.2重量％)，NH4NO3(1-1.5重量％)，MgSO4(0.03-0.08重量％)，CaCl2(0.001-0.003重量％)，FeSO4·7H2O(0.01-0.03重量％)的混合无机盐溶液为例，基于每千克的所述含有二氯喹啉酸污染的环境，上述无机盐混合液的加入量可以为1-3ml/天。
根据本发明，当所述含有二氯喹啉酸的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的脱氮假单胞菌对二氯喹啉酸的降解效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中：
LB液体培养基：0.8-1％蛋白胨，0.5-0.8％酵母粉，1-1.5％氯化钠， pH＝6.8-7.0。
无机盐培养基(重量)：KH2PO4(0.8-1.2％)，K2HPO4(0.8-1.2％)，NH4NO3(1-1.5％)，MgSO4(0.03-0.08％)，CaCl2(0.001-0.003％)，FeSO4·7H2O(0.01-0.03％)，pH＝6.0-7.5。
本发明的菌株为脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)，以下简称为W-7，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10845。
参比的菌株：铜绿假单胞菌，以下简称菌株D。
二氯喹啉酸的测定方法：将1mL待测样品加入到2mL离心管中，每个处理设3个重复。分别加入0.25mL氯仿-正丁醇混合溶液[F(氯仿):F(正丁醇)＝4:1]，充分振摇30min后，于12000rpm下离心2min，将上层水相转移到新的离心管中，重复上述操作提取2次。之后再将处理好的样品12000rpm离心5min，过0.22滤膜后用液相色谱测定。
液相色谱检测条件釆用Athana C18色谱柱，流动相厂(甲醇):「(0.2％乙酸水溶液)＝60:40，柱温30V，流速0.8mL/min，检测波长(UV)240nm，进样量20nL。
二氯喹啉酸的降解率＝(初始二氯喹啉酸浓度-处理后二氯喹啉酸浓度)/初始二氯喹啉酸×100％
制备例
将菌株W-7和参比菌株分别在LB液体培养基中170rpm下活化2次，活化温度为30±1℃，时间为9小时。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的脱氮假单胞菌在水相(LB液体培养基)中对二氯喹啉酸的耐受性及降解性
将菌株W-7以1体积％的接种量接入灭菌后的含有浓度分别为30mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L和300mg/L的二氯喹啉酸的LB液体培养基中。在170rpm，30±1℃条件下培养24h，结果显示，菌株W-7对二氯喹啉酸显示了很好的耐受性，在不同培养基中菌株都能生长。菌体能达到的最大OD值以及对二氯喹啉酸的降解率见表1。
对比例1-1
本对比例用于说明自然状态下水中二氯喹啉酸的降解性(空白对照)
分别按照实施例1的方法进行测试，不同的是，在含有二氯喹啉酸的LB培养基中均不接种任何菌株。结果见表1。
对比例1-2
本对比例用于说明参比菌株对水中二氯喹啉酸的耐受性和降解性
分别按照实施例1的方法进行测试，不同的是，在含有二氯喹啉酸的LB培养基中接种的为参比菌株。结果见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的脱氮假单胞菌在水相(无机盐培养基)中对二氯喹啉酸的耐受性及降解性
将菌株W-7以1体积％的接种量接入灭菌后的含有浓度分别为30mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L和300mg/L的二氯喹啉酸的无机盐培养基中。在170rpm，30±1℃条件下培养24h。结果显示，菌株W-7对二氯喹啉酸 显示了很好的耐受性，在不同培养基中菌株都能生长。在以二氯喹啉酸为唯一碳源的情况下，菌体能达到的最大OD值以及对二氯喹啉酸的降解率见表1。
对比例2-1
本对比例用于说明自然状态下水中二氯喹啉酸的降解性(空白对照)
分别按照实施例2的方法进行测试，不同的是，在含有二氯喹啉酸的无机盐培养基中均不接种任何菌株。结果见表1。
对比例2-2
本对比例用于说明参比菌株对水中二氯喹啉酸的降解性
分别按照实施例2的方法进行测试，不同的是，在含有二氯喹啉酸的无机盐培养基中接种的为参比菌株。结果见表1。
表1
由表1可以看出，本发明提供的脱氮假单胞菌在水中对二氯喹啉酸具有较强的耐受性，并且对生存环境要求宽松，在仅提供有二氯喹啉酸作为碳源 的无机盐培养基中也能够进行生长，并对二氯喹啉酸进行有效的降解。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的脱氮假单胞菌在土壤中对二氯喹啉酸的降解性
将菌株W-7以1体积％菌种量接种到100mL的LB液体培养基中，175rmp，30±1℃下培养24h后，将菌液加入到5kg含有20mg/kg的二氯喹啉酸的污染土壤中，搅拌均匀，培养7天，保证含土壤中的水量为20％左右，在第3天、第5天以及第7天分别检测土壤中二氯喹啉酸的含量，结果见表2。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的脱氮假单胞菌在土壤中对二氯喹啉酸的降解性
将菌株W-7以1体积％菌种量接种到100mL的LB液体培养基中，175rmp，30±1℃下培养24h后，取1mL菌液加入到5kg含有20mg/kg的二氯喹啉酸的污染土壤中，搅拌均匀，并每天加入10mL无机盐培养基，培养7天，保证含土壤中的水量为20％左右，在第3天、第5天以及第7天分别检测土壤中二氯喹啉酸的含量，结果见表2。
对比例3-1
本对比例用于说明自然状下土壤中二氯喹啉酸的降解性
分别按照实施例3的方法进行测试，不同的是，在土壤中仅加入相同量的不含有任何菌株LB培养液。结果见表2。
对比例3-2
本对比例用于说明参比菌株在土壤中二氯喹啉酸的降解性
分别按照实施例3的方法进行测试，不同的是，在土壤中接种的为参比菌株。结果见表2。
表2
由表2可以看出，本发明提供的脱氮假单胞菌对土壤中的二氯喹啉酸能够进行有效的降解。另外，在优选加入无机盐的情况下，本发明提供的脱氮假单胞菌对二氯喹啉酸的降解率能够得到进一步提高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。