本发明属于中成药质量控制技术领域，具体涉及用SMRT测序技术及DNA条形码分子鉴定技术监测中成药生物物种组成的方法。
背景技术：
现行版《中国药典》对中成药质量控制的方法主要包括显微鉴别、薄层色谱鉴别、含量测定、指纹图谱等。然而，薄层色谱鉴别和含量测定仅可对中成药中是否含有目标化学成分进行定性或定量监测，无法判定该目标化学成分是来源于中成药处方中的相应药材或是人为添加。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的相对较短的DNA序列极性物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统鉴定方法的有效补充。2015年版《中国药典》收载中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则，将其作为中药材质量控制方法之一，现已获得广泛应用。单分子测序技术，又称第三代测序技术，包括单分子荧光测序和纳米孔测序两大类，如美国太平洋生物公司(Pacific Bioscience)的Pacbio RSII测序平台，美国螺旋生物公司(Helicos)的Heliscope单分子测序平台，英国牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)的MinION测序平台等，均具有读长长、速度快、精度高等特点。目前该技术主要应用于基因组测序、DNA甲基化研究、SNP检测等方面。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成成分的监测方法，该方法能够对现有中成药质量控制方法进行有效补充，维护临床用药安全。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成成分的监测方法，其包括如下步骤：
1)提取待检样品基因组DNA。
2)以上述DNA为模板，扩增其ITS2序列和psbA-trnH序列。
3)基于Pacbio RSII测序平台，依照该平台标准操作流程，对上述PCR产物进行文库构建，并进行SMRT测序。
4)应用SMRT Analysis Server 2.3.0软件对原始数据进行过滤，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程获得环状一致性序列(circular-consensus sequencing，CCS)，用CD-HIT软件将CCS序列进行聚类，最终获得可用于后续分析的ITS2和psbA-trnH序列。
5)将上述序列放入中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，进行BLAST比对，获得物种鉴定结果。
扩增引物使用的ITS2序列引物，其序列为：
正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；
反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。
扩增引物使用的psbA-trnH序列引物，其序列为：
正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC
反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
上述引物用于扩增中成药中各个药材的ITS2序列和psbA-trnH序列。
本发明还提供含有上述引物的中成药生物物种组成成分监测相关试剂盒。
本发明方法适用性广，能检测所有能扩增出ITS2序列或psbA-trnH序列的中成药样品。因此，能够实现中成药的生物物种组成成分的监测，对现有中成药质量控制方法进行有效补充，维护临床用药安全。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，而并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所做出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
1.材料：
试验材料为中成药九味羌活丸，本实施例所用材料为依照《中国药典》中该中成药处方的规定剂量及制法，在实验室自制。此外，为验证本方法的灵敏度，根据该处方中剂量最小的一味药材细辛的用量，加入等量人参药材作为阳性对照。
2.实验步骤：
1)中成药九味羌活丸处方由羌活、防风、黄芩、细辛、地黄、川芎、苍术、白芷和甘草共9味中药组成。本实施例所用到的各个药材均已经过形态学及DNA条形码鉴定，以确保其物种的准确性，因苍术和白芷未能获得DNA条形码序列，故由形态学鉴定其物种。依照《中国药典》规定剂量及制法，将上述药材及阳性对照药材人参混合粉碎并过筛，制成丸剂。
2)DNA提取
取120mg上述样品，用MM400高通量组织研磨仪(德国Retsch)研磨，用核分离液漂洗至上清液无色，用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA。
3)PCR扩增及产物回收
分别扩增所提取DNA的ITS2序列和psbA-trnH序列。扩增引物使用的ITS2序列正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。扩增引物使用的psbA-trnH序列正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC，由生工生物工程有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol/μL。
25μL反应体系：2×PCR MasterMix 12.5μL，正反向引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 20～100ng，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行ITS2序列和psbA-trnH序列扩增反应：
PCR产物经凝胶电泳后，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN N.V.，德国)进行切胶回收，获得纯化产物。
5)文库构建、SMRT测序及数据处理
本实施例基于Pacbio RSII测序平台，依照该平台标准操作流程，对上述PCR产物进行文库构建，并进行SMRT测序。
应用SMRT Analysis Server 2.3.0软件对原始数据进行过滤，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程获得环状一致性序列(circular-consensus sequencing reads，CCS reads)，本实施例获得ITS2序列和psbA-trnH序列。
6)物种鉴定
将上述序列放入中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，进行BLAST比对，获得物种鉴定结果。本实施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列经BLAST比对后，结果如下：
ITS2序列能够检出羌活、防风、细辛、川芎、地黄、甘草。
psbA-trnH序列能够检出羌活、川芎、黄芩、甘草以及阳性对照药材人参。
ITS2序列与psbA-trnH序列结合，未能检出苍术、白芷，这与实验步骤1)中DNA条形码鉴定结果一致。
该结果显示本发明所公开的基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成监测方法能够用于实验室自制中成药九味羌活丸的物种组成监测，具有良好的可行性。
实施例2
1.材料：
基本同实施例1，所不同的是没有加入实施例1中的阳性对照药材人参。
2.实验步骤：
同实施例1。
本实施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列经BLAST比对后，结果如下：
ITS2序列能够检出羌活、防风、细辛、川芎、地黄、甘草。
psbA-trnH序列能够检出羌活、川芎、黄芩、甘草。
ITS2序列与psbA-trnH序列结合，未能检出苍术、白芷。与实施例1一致。
该结果显示本发明所公开的基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成监测方法能够用于实验室自制中成药九味羌活丸的物种组成监测，具有良好的可行性。
实施例3
1.材料：
试验材料为由某制药厂生产的具备药品批准文号的中成药九味羌活丸(批号：20141101)，购买自某药店。
2.实验步骤：
基本同实施例1，所不同的是本实施例由DNA提取步骤开始，逐步完成实验操作和数据处理，直至物种鉴定。
本实施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列经BLAST比对后，结果如下：
ITS2序列能够检出羌活、苍术、细辛、川芎、甘草。
psbA-trnH序列能够检出羌活、防风、苍术、川芎、黄芩、甘草。
ITS2序列与psbA-trnH序列结合，未能检出地黄、白芷。其原因可能为，本实施例所用中成药试验样品中上述两个物种DNA降解严重，或该中成药在制剂过程中未按照《中国药典》规定加入上述两种中药材的粉末。
该结果显示本发明所公开的基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成监测方法能够用于市售中成药九味羌活丸的物种组成监测，具有良好的可行性。
实施例4
1.材料：
试验材料为由某制药厂生产的具备药品批准文号的中成药九味羌活丸(批号：20140501)，购买自某药店。
2.实验步骤：
基本同实施例1，所不同的是本实施例由DNA提取步骤开始，逐步完成实验操作和数据处理，直至物种鉴定。
本实施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列经BLAST比对后，结果如下：
ITS2序列能够检出羌活、防风、苍术、细辛、川芎、甘草。
psbA-trnH序列能够检出川芎、甘草。
ITS2序列与psbA-trnH序列结合，未能检出黄芩、地黄、白芷。其原因可能为，本实施例所用中成药试验样品中上述三个物种DNA降解严重，或该中成药在制剂过程中未按照《中国药典》规定加入上述两种中药材的粉末。
该结果显示本发明所公开的基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成监测方法能够用于市售中成药九味羌活丸的物种组成监测，具有良好的可行性。
实施例5
1.材料：
试验材料为由某制药厂生产的具备药品批准文号的中成药九味羌活丸(批号：20140501)，购买自某药店。
2.实验步骤：
基本同实施例1，所不同的是本实施例由DNA提取步骤开始，逐步完成实验操作和数据处理，直至物种鉴定。
本实施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列经BLAST比对后，结果如下：
ITS2序列能够检出羌活、防风、苍术、细辛、川芎、甘草。
psbA-trnH序列能够检出羌活、苍术、川芎、黄芩、甘草。
ITS2序列与psbA-trnH序列结合，未能检出地黄、白芷。其原因可能为，本实施例所用中成药试验样品中上述两个物种DNA降解严重，或该中成药在制剂过程中未按照《中国药典》规定加入上述两种中药材的粉末。
该结果显示本发明所公开的基于SMRT测序技术的中成药生物物种组成监测方法能够用于市售中成药九味羌活丸的物种组成监测，具有良好的可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。