本发明属于植物熊果酸的提取技术领域，涉及一种以金露梅为原料制备高纯度熊果酸的方法。
背景技术：
金露梅又名金老梅药，药王茶，金腊梅等，有效成份丰富，种类繁多。具有很好的药理作用，在开花盛期月直接采集花、叶，去掉老枝，阴干，即可入药。味微甘，性凉。具有清暑热，益脑清心，健胃消食，健脾化湿，调经等功能。主治消化不良，浮肿，赤白带下，乳腺炎等。
熊果酸(Ursolid acid)又名乌索酸，乌苏酸，是存在于天然植物中的一种五环三萜化合物，纯品为白色针状结晶，分子式为C30H18O3，不溶于水和石油醚，易溶于二氧六环、醇和甲醇，可溶于苯、氯仿。熊果酸具降低血脂，血糖等多种生物学效应。近年来发现它具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用，极有可能成为低毒高效的新型抗癌药物。另外，熊果酸具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。
针对熊果酸的开发现状和药用前景，本发明将目标定位于从金露梅中分离纯化熊果酸的工艺技术研究，为工业化生产提供较为详尽的技术方案和基础数据。因此，寻找流程短、成本低、适于工业化规模生产的工艺流程是本研究的重点。新工艺具有产品纯度高、工艺收率高和生产成本低的特点，确保了金露梅中熊果酸开发的高效益和强竞争力，为金露梅的产业化开发奠定了基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从金露梅中制备高纯度熊果酸的工业化方法。本发明先采用微波逆流提取技术对金露梅进行提取，再利用超滤膜超滤进行除杂，然后利用碱化和酸性水溶液沉降的方法对熊果酸进行富集，采用弱极性大孔吸附树脂进行分离纯化，最后采用重结晶的方法获得高纯度的熊果酸产品。
本发明的技术方案是这样实现的，它包括以下步骤：
(1)微波逆流提取
将金露梅干叶粉碎，过筛60～80目，加入80-95％乙醇溶液，在400～600W，时间60～120min，6～10倍料液比条件下微波逆流提取，正向进料，反向进水，物料与水的流动为逆向连续动态流动，得到含有熊果酸的提取液；
(2)超滤膜超滤
提取液温度冷至室温后，分别用截留分子量4000，6000，10000，20000道尔顿的聚醚砜超滤膜，在操作压差为0.1MPa时，进行超滤，有效地去除去除提取液中的固形物、色素和大分子物质；
(3)碱化
超滤后的提取液，以1％NaOH调溶液的pH分别为10～12，50℃水浴加热10min，冷却至室温后，有红棕色沉淀析出，过滤，取上清液；
(4)酸性水溶液沉降
上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝2～4，再用1，1.5，2，2倍溶液体积的PH＝2～4的酸性水溶液稀释，50℃水浴加热20imn，室温静置2h，使熊果酸析出并沉降，过滤，所得沉淀经水洗至中性后，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥得熊果酸粗产品；
(5)树脂纯化
取经预处理的大孔树脂，采用湿法装柱，柱温25℃，将熊果酸粗品配制成浓度3mg/mL样品上样，控制它的上样流速为1.0～3.0BV/h进行动态吸附，样品溶液经过水以4-6BV/h流速洗去水溶性杂质，采用梯度洗脱方式，采用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇，以1～3BV/h流速逐步将杂质洗脱下来。
(6)重结晶
由洗脱剂组合洗脱后，将收集的90％乙醇(pH＝11)洗脱液旋转蒸发，余液用5％的H2SO4调节至pH＝4，析出沉淀过滤后水洗至中性，得白色粉末，用无水乙醇重结晶三次得白色针状晶体。
所述步骤(1)中，提取温度为70～90℃，原料∶提取液＝1∶10～1∶14(m/v)，提取时间为60～120min，连续提取2次；
所述步骤(4)中，真空冷冻干燥预冻温度-30℃，工作压力20Pa，升华温度55℃，解析温度60℃；
所述步骤(5)中，大孔树脂分别为BS-101、AB-8和X-5；
所述步骤(5)中，水洗洗脱体积为5-7BV，洗脱剂洗脱体积为4-6BV；
具体实施方式
实施例1
金露梅干叶粉碎至60目，加入80％乙醇溶液，在600W，时间120min，10倍料液比条件下微波逆流提取，正向进料，反向进水，物料与水的流动为逆向连续动态流动，收集提取液；将收集到的提取液冷至室温，用截留分子量6000道尔顿的聚醚砜超滤膜，在操作压差为0.1MPa时进行超滤；超滤后的提取液，以1％NaOH调溶液的pH＝10，50℃水浴加热10min，冷却至室温后，过滤，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝2，再用1倍溶液体积的PH＝2的酸性水溶液稀释，50℃水浴加热20imn，室温静置2h，使熊果酸析出并沉降，过滤，所得沉淀经水洗至中性后，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥得熊果酸粗产品；将熊果酸粗品配制成浓度3mg/mL样品上样，采用BS-101型大孔吸附树脂对其纯化，控制它的上样流速为1BV/h进行动态吸附，样品溶液经过水以4BV/h流速洗去水溶性杂质，水洗洗脱体积为5BV，采用梯度洗脱方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以1BV/h流速洗脱逐步将杂质洗脱下来，洗脱剂洗脱体积为4BV；由洗脱剂组合洗脱后，将收集的90％乙醇(pH＝11)洗脱液旋转蒸发，余液用5％的H2SO4调节至pH＝4，析出沉淀过滤后水洗至中性，得白色粉末，用无水乙醇重结晶三次得白色针状晶体。
实施例2
金露梅干叶粉碎至70目，加入85％乙醇溶液，在500W，时间90min，12倍料液比条件下微波逆流提取，正向进料，反向进水，物料与水的流动为逆向连续动态流动，收集提取液；将收集到的提取液冷至室温，用截留分子量10000道尔顿的聚醚砜超滤膜，在操作压差为0.1MPa时进行超滤；超滤后的提取液，以1％NaOH调溶液的pH＝11，50℃水浴加热10min，冷却至室温后，过滤，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝3，再用1.5倍溶液体积的PH＝3的酸性水溶液稀释，50℃水浴加热20imn，室温静置2h，使熊果酸析出并沉降，过滤，所得沉淀经水洗至中性后，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥得熊果酸粗产品；将熊果酸粗品配制成浓度3mg/mL样品上样，采用AB-8型大孔吸附树脂对其纯化，控制它的上样流速为2BV/h进行动态吸附，样品溶液经过水以5BV/h流速洗去水溶性杂质，水洗洗脱体积为6BV，采用梯度洗脱方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以2BV/h流速洗脱逐步将杂质洗脱下来，洗脱剂洗脱体积为5BV；由洗脱剂组合洗脱后，将收集的90％乙醇(pH＝11)洗脱液旋转蒸发，余液用5％的H2SO4调节至pH＝4，析出沉淀过滤后水洗至中性，得白色粉末，用无水乙醇重结晶三次得白色针状晶体。
实施例3
金露梅干叶粉碎至80目，加入90％乙醇溶液，在400W，时间60min，14倍料液比条件下微波逆流提取，正向进料，反向进水，物料与水的流动为逆向连续动态流动，收集提取液；将收集到的提取液冷至室温，用截留分子量20000道尔顿的聚醚砜超滤膜，在操作压差为0.1MPa时进行超滤；超滤后的提取液，以1％NaOH调溶液的pH＝12，50℃水浴加热10min，冷却至室温后，过滤，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝4，再用2倍溶液体积的PH＝4的酸性水溶液稀释，50℃水浴加热20imn，室温静置2h，使熊果酸析出并沉降，过滤，所得沉淀经水洗至中性后，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥得熊果酸粗产品；将熊果酸粗品配制成浓度3mg/mL样品上样，采用X-5型大孔吸附树脂对其纯化，控制它的上样流速为3BV/h进行动态吸附，样品溶液经过水以6BV/h流速洗去水溶性杂质，水洗洗脱体积为7BV，采用梯度洗脱方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以3BV/h流速洗脱逐步将杂质洗脱下来，洗脱剂洗脱体积为6BV；由洗脱剂组合洗脱后，将收集的90％乙醇(pH＝11)洗脱液旋转蒸发，余液用5％的H2SO4调节至pH＝4，析出沉淀过滤后水洗至中性，得白色粉末，用无水乙醇重结晶三次得白色针状晶体。