一种X连锁无汗性外胚层发育不良突变基因及其应用的制作方法

本发明涉及基因诊断技术领域，具体地说，涉及一种新的导致X连锁无汗性外胚层发育不良的突变位点及其应用。

背景技术：

外胚层发育不良(ecodermal dysplasias，EDs)的概念是由Thurman于1848年首先提出，其后Wedderhorn做了详细的描述。临床上根据有无发汗分为有汗性外胚层发育不良和无汗/少汗性外胚层发育不良。ED按孟德尔遗传规律传递，遗传方式包括常染色体显性、常染色体隐性、X连锁显性和隐性遗传。

X连锁少汗或无汗性外胚层发育不良(X-linked hypohidrotic or anhidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)亦称为Christ-Siemens-Touraine综合征，出生患病率为1/100,000。典型的临床表型为无汗或少汗、毛发稀疏或全秃、少牙或牙形态异常等三联症，具有较大的异质性。因为是X连锁遗传，所以患病男性表现出所有或绝大部分临床典型表现，女性携带者则表现较轻，不同家系表现不同，甚至同一家系表现亦相差较大。

EDA基因编码EDA蛋白(ectodysplasinA)。EDA基因位于Xq12-q13，共有12个外显子，其中8个外显子编码EDA蛋白。EDA基因的任何一个domain突变均可导致XLHED，现发现该基因有200多个突变，突变形式包括缺失突变及插入突变，但80％的病例只有一个突变。EDA蛋白及其介导的信号通路对外胚层起源器官的发育十分重要，如头发、指甲、垂体、乳腺、汗腺、鼻、眼及牙齿形成等。

ED是一组遗传异质性疾病，可导致程度不同的出生缺陷，严重威胁患者的身心健康。严重者幼儿时期反复高热发作，可导致死亡。及早诊断和采取相应应对措施有利于防止高热发作，减少并发症，降低死亡率。免疫缺陷性少汗性ED是外胚层发育不良的一种罕见类型，其治疗包括预防治疗和病因治疗等。尽管如此，多年来儿童XLHED死亡率约30％，婴儿期，高热、呼吸道感染是常见并发症。因此，如何减少ED所致出生缺陷、如何减少该病死亡率是每一位科研及临床医务人员不可推卸的责任。随着种植前遗传学诊断(PGD)技术的进一步发展，将来可以利用基因芯片技术对现有外胚层发育不良家系提供分子学产前诊断，进一步提供遗传咨询，减少出生缺陷，为我国的优生优育作贡献。鉴于此，探索ED发生的遗传机制，发现更多ED的致病性突变将有利于ED产前诊断和遗传咨询的开展。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新的导致ED的突变位点。

第一方面，本发明提供了检测EDA基因第6号内含子起始端第二个碱基的试剂在制备诊断X连锁无汗性外胚层发育不良的试剂或试剂盒中的应用。

第二方面，本发明提供了一种诊断X连锁无汗性外胚层发育不良的试剂盒，所述的试剂盒含有检测EDA基因第6号内含子起始端第二个碱基的试剂。

进一步地，所述的试剂盒含有操作说明书，所述的操作说明书记载有以下内容：如果EDA基因第6号内含子起始端第二个碱基为A，则检测对象为X连锁无汗性外胚层发育不良个体。

本发明优点在于：

本发明通过对一X连锁无汗性外胚层发育不良家系EDA基因PCR扩增及序列测定，发现本家系中IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)突变为剪切致病突变，属国内外首报，是X连锁无汗性外胚层发育不良的新发现致病突变。该突变可用于ED的产前诊断和遗传咨询，减少出生缺陷。基于此，可将检测EDA基因第6号内含子起始端第二个碱基的试剂用于制备诊断ED的试剂，开发诊断试剂盒。

附图说明

图1.先证者表型。

图2.XLHED家系图。

图3.XLHED家系基因测序图(部分)。P1为Ⅱ:3；P2为Ⅱ:2；P8为Ⅲ:6；P9为Ⅳ:1；P10为Ⅲ:7；P11为Ⅳ:3；P12为Ⅲ:8；P13为Ⅳ:2；P3、4、5、6、7分别为Ⅲ:3、Ⅲ:4、Ⅲ:5、Ⅲ:2、Ⅲ:1，未列出。

图4.DNAsisst软件比对图。0为基因组标准序列70030468-70030520，8和10为患者，其余为家系其他正常成员。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、资料与方法

1.临床资料

先证者(图1，图2中Ⅲ7)：男性，汉族，44岁，出生时即发现其全身毛发稀少，长大后发现头发稀黄、体毛稀少，牙齿稀疏，指趾甲发育未见异常，夏季不出汗，易发热，皮肤干燥，智力正常；特殊面容：前额突出，鞍状鼻，无鼻毛，唇厚外翻；追问病史：先证者出生后即无头发，幼儿期常出现无诱因发热，发热程度与环境温度相关。患者母亲已离世，表现出轻微症状：头发稀疏，缺门牙3颗。患者父亲体健，非近亲结婚。因患者拒绝取皮肤行病理学检测而无法得到该病理学结果，但是家系先证者经两所三级甲等医院的不同皮肤科医生诊断为少汗性外胚层发育不良。先证者生育1子，身体健康，现19岁，排汗、牙齿发育、毛发等未见异常，先证者有一哥哥(图2中Ⅲ6)，留取血样半年后去世，表现与其相似，育有一子一女，均体健；患者还有一弟弟，身体健康，未生育。

2.方法

2.1基因组DNA制备

获得所有家庭成员知情同意后，采集患者及其家系其他健在成员外周静脉血，EDTA抗凝，Dzup基因组DNA抽提试剂盒(上海生工，B518201)提取全家系基因组DNA。TE缓冲液溶解，NanoDrop ND-1000紫外分光光度计定量备用。

2.2PCR扩增EDA基因的外显子

利用软件Primer3对参与该基因编码的8个外显子及临界区域进行引物设计(见表1)，对8个外显子及其上下游100bp临界区域的DNA进行PCR扩增。反应体系50μl，含100ng DNA；10pmol dNTPs；各20pmol上下游引物；10×PCR Buffer 5μl(200mM Tris-HCl(pH8.8)、100mM KCl、160mM(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、1.0mg/ml BSA、1.0％TritonX-100)；5Unit Pfu DNA聚合酶。反应条件：95℃预变性60s，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，最后72℃最终延伸5min，共35个循环。扩增后产物于1.5％琼脂糖(含溴化乙啶0.5g/mL)凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司基因测序，所用测序仪为ABI测序仪(3730xlDNAAnalyzer)。Chromas(version 2.4.1)软件读取测序结果，同时输出DNA序列。以美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的基因组序列为参考序列，用DNAssit(version 2.2)比对并找到突变位点后Chromas截取峰形图并存档。

表1EDA外显子1-8PCR扩增引物序列

二、结果

1.PCR产物测序结果

先证者及其哥哥(图2中Ⅲ6、Ⅲ7)DNA使用8对引物在前述条件下分别扩增出相应产物，测序显示其中第6号内含子起始端第二个碱基发生突变，IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)。家系其他成员均无此突变(图3，图4)。

IVS 6+2T>A(g.69250372)突变位置位于该内含子的剪切供体位置，其发生突变可导致基因的mRNA剪切异常，从而导致EDA蛋白的数量或结构发生异常，影响信号转导。由于该家系连续3代均出现发病者，且男女均可受累，符合X染色体隐性遗传特点，且发病者均具有典型临床表现，基因检测有相同的突变位点，正常人群及家系其他不发病成员无类似突变，因此综合以上特点证实IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)突变为剪切致病性突变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第一人民医院

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