基于化学氧化和酶催化结合技术制备熊去氧胆酸的方法与流程

本发明涉及化学氧化和生物技术的综合领域，具体涉及一种化学氧化和生物酶催化结合型氧化还原法制备熊去氧胆酸的方法，该方法基于NBS在丙酮中氧化鹅去氧胆酸生成7-羰基-石胆酸，再利用重组大肠杆菌的高密度发酵产生的7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)，结合辅酶的作用，催化7-羰基-石胆酸转化为熊去氧胆酸的方法。

背景技术：

熊去氧胆酸，英文名：ursodesoxycholic acid(UDCA)，是常用大宗药材，《中国药典》及美国等药典收载品种，疗效明确，毒副作用少且低，国内外有着非常广泛的用途，市场用量大。国内主要用于治疗胆结石、胆囊炎、胆管炎、胆汁性消化不良、黄疸及促进肝移植等方面且有较好的治疗效果；对胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化及药物诱发的肝炎，也有非常好的疗效。美国等一些发达的西方国家，主要用来预防胆结石形成，这些国家饮食以肉类物质为主要来源，能量及热量高且密集、富于油脂等特点，患胆结石几率较高，本着预防等目的，普通民众食用熊去氧胆酸来预防胆结石形成。

传统获得熊去氧胆酸的方法需要采集大量牛、鹅胆汁提取鹅去氧胆酸(CDCA)，通过氧化还原法使7-OH发生构型反转，应用系列化学氧化剂和还原剂将原料合成UDCA，最后还需进行产品纯化。传统化学合成UDCA的方法存在反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题，因此UDCA的工业化进程受到限制。

此外，基于组合酶催化技术制备熊去氧胆酸的方法目前也比较普遍，生物组合酶催化法克服了传统化学方法的各种缺点，但是生物组合酶催化法催化鹅去氧胆酸生成熊去氧胆酸的方法成本较高，生物组合酶催化法生产的熊去氧胆酸的价格相对也较为昂贵，因此没有市场竞争力。基于传统的制备熊去氧胆酸的几种方法，我们对熊去氧胆酸的制备方案进行了改进，克服了化学方法的危险、能耗大、污染大、选择性低的缺点，结合了生物催化法选择性高的优点，从而提出了效率高、成本低的制备熊去氧胆酸的新思路、新方法。

技术实现要素：

本项目提出以鹅去氧胆酸为原料，利用NBS氧化丙酮溶解的鹅去氧胆酸生成7-羰基-石胆酸，再结合利用生物酶7β-HSDH将7-羰基-石胆酸(7k-LCA)催化合成UDCA的新思路，研究开发环保、绿色、高效的熊去氧胆酸的合成技术及工艺，并且熊去氧胆酸的生产成本大大降低。利用NBS氧化丙酮溶解的鹅去氧胆酸生成7-羰基-石胆酸的效率高，成本低的特点，结合使用重组大肠杆菌在特定温度下进行高密度发酵，产生高纯度、高活性的催化酶(7β-HSDH)，催化酶可选择性的催化7-羰基-石胆酸(7k-LCA)，生成纯度较高的熊去氧胆酸(UDCA)，是环保、绿色、高效的熊去氧胆酸酶催化合成新技术。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定：

实施例1

利用化学氧化法氧化鹅去氧胆酸生成中间体7-羰基-石胆酸的方法，具体包括以下步骤：

(1)取鹅去氧胆酸6g溶于10倍体积的丙酮水溶液中，丙酮-水的体积比为2.7：1，待完全溶解，加入NBS4g，30℃搅拌1.5h。待反应完全后，加入40％的NaHSO₃，用500ml水稀释，使产物析出。

(2)过滤反应液Ⅰ，烘干产物，干燥，得到白色疏松的7-羰基-石胆酸粉末Ⅰ。

实施例2

原料CDCA的含量分析

取粉末Ⅰ约0.1g于50ml容量瓶中，加入甲醇适量，超声(功率300W，频率25kHz)5min使之溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液，10l，通过高效液相色谱仪，采用蒸汽发光散射检测器，记录色谱图1，对色谱图进行分析，CDCA的百分比含量为98％。对照品CDCA来自于中国药品生物制品检定所。

实施例3

反应液Ⅰ处理完后的粉末Ⅰ中的7K-LCA的含量分析

取粉末Ⅰ约0.1g于50ml容量瓶中，加入甲醇适量，超声(功率300W，频率25kHz)5min使之溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液，10l，通过高效液相色谱仪，采用蒸汽发光散射检测器，记录色谱图2，对色谱图进行分析，7K-LCA的百分比含量为99％。对照品7K-LCA来自于中国药品生物制品检定所。

实施例4

7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的表达

大肠杆菌：BL21(DE3)菌株，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio Life Science)。

表达载体pGEX-6p-1：购自生工生物(上海)股份有限公司。

用于发酵催化酶的7β-羟基类固醇脱氢酶的基因序列由生工生物(上海)股份有限公司进行全基因合成，基因合成后与表达载体pGEX-6p-1连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白质的表达，用氨苄抗性的培养基筛选转化成功的表达菌株，扩大培养后，转入摇瓶培养，将重组菌株按5％的添加量加入LB液体培养基中，220rmp、37℃培养。待OD₆₀₀为0.5时，25℃IPTG诱导16小时，大肠杆菌表达带有GST标签的7β-HSDH融合蛋白。将诱导完成的大肠杆菌培养液10000rmp离心10min，收集菌体，弃培养液，加入10倍体积的PBS溶液，超声破碎菌液20min，至菌液澄清；4℃10000rmp离心20分钟，收集上清液；上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepharose 4B medium，购自BBI Life Science公司)4℃结合4h，使GST融合蛋白结合于谷胱甘肽标签分离树脂(GST-Sefinose^TM Resin，购自BBI Life Science公司)，分离融合蛋白，用五倍体积的PBS(100mM)冲洗三次。利用切GST标签的切割酶(Recombinant PreScission Protease,Low Endotoxin，购自BBI Life Science公司)，4℃或室温条件下切割16h，离心得到目的蛋白。严格按照BBI Life Science公司纯化融合蛋白和酶切融合蛋白的步骤进行操作。

实施例5

利用7β-HSDH酶催化7K-LCA制备熊去氧胆酸

利用大肠杆菌的高密度发酵产生的催化酶，催化7-羰基-石胆酸，制备熊去氧胆酸的方法，具体包括以下几个步骤：

取2g7K-LCA粉末，溶于100mlpH8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)；超声5min，待完全溶解，加入0.02g的NADPH，加入5ml的7β-HSDH(酶总量为800g)；30℃反应0.5h。

实施例6

反应产物后处理

将实施例5中的转化液调至pH为酸性，使7β-HSDH变性和产物结晶，采用高速离心机离心，10000rmp离心20min，除去蛋白和溶液，蒸馏除去剩余溶剂液，得到熊去氧胆酸粗品；将得到的熊去氧胆酸粗品和乙酸乙酯加入反应容器中，升温并回流1小时，降温至常温，过滤得到纯度大于99％熊去氧胆酸。

实施例7

高效液相质谱检测前的样品处理

对于实施例6处理完的产物，取1g，加50％的甲醇水溶液定容至50ml。

实施例8

液相质谱(HPLC-MS)检测样品的方法

取实施例7所处理的溶液10l，过滤，加入质谱仪进行分析，采用的雾化器温度为80℃，N₂流量3.0ml/min，C₁₈色谱柱。质谱条件采用40℃柱温，1.0ml/min流速；流动相A:0.1％乙腈，流动相B:0.1％甲酸。50％A和50％B等度洗脱25min。记录质谱曲线图，如图3。

实施例9

高效液相色谱蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测前的样品处理

对于实施例6处理完的产物，取0.5g的样品，加入20ml的50％的甲醇水溶液中。

实施例10

高效液相色谱蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测样品的方法

取实施例9所处理的溶液10l，过滤，加入高效液相色谱仪进行分析，采用的雾化器温度为80℃，N₂流量3.0ml/min，C₁₈色谱柱。色谱条件采用40℃柱温，1.0ml/min流速；记录色谱曲线图，如图4，计算结果分析得：熊去氧胆酸含量为99％以上。

上述实施例说明通过化学氧化和生物酶催化联用的两步法制备熊去氧胆酸的方法是非常有效的，7位的羟基发生构型反转，且该反应仅对7位的羟基发生了作用。化学氧化高效且成本较低，生物酶催化还原的专一性，使用化学氧化和生物酶催化还原法联用制备熊去氧胆酸，克服了化学方法的危险、能耗大、污染大、选择性低的缺点，结合了生物催化法选择性高的优点，使得熊去氧胆酸的制备效率大大提高、成本大大降低。

附图说明

图1 HPLC-ELSD检测原料中鹅去氧胆酸的含量，检测结果显示鹅去氧胆酸的含量为98％。

图2 HPLC-ELSD检测化学氧化的转化液处理后的7k-LCA的含量，检测结果显示7k-LCA的含量为99％。

图3质谱检测酶催化还原7k-LCA生成UDCA，检测结果显示该反应有很明显的熊去氧胆酸生成，熊去氧胆酸的含量明显多于原料7k-LCA的含量，并且原料7k-LCA几乎没有残留。

图4 HPLC-ELSD检测得到熊去氧胆酸的含量，检测结果显示熊去氧胆酸的含量为99％。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员可以轻松理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。