一种基于蛋清的细胞微载体及其制备方法与流程

本发明属于三维细胞培养微载体材料研究技术领域，具体涉及一种蛋清细胞微载体及其制备方法。

背景技术：

微载体作为实现三维细胞培养的通用工具，在组织工程学的诸多领域具有极大的应用潜力。微载体是一种允许粘着性细胞在生物反应器中生长的支持基质，其尺度处于微米级，微载体适宜的密度使其在轻柔的搅拌下能保持悬浮状态。目前，有多种材料可用于制备微载体，例如葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺共聚物、胶原以及海藻酸盐等。这些微载体材料结合不同的表面化学成分(例如：细胞外基质蛋白、重组蛋白、多肽以及带正电或负电的分子)可以影响细胞形态、细胞扩增等细胞行为。细胞扩增是组织工程中至关重要的部分，因为细胞是组织形貌和功能的重建的根本，而微载体则能使细胞在生物反应器中快速增殖。微载体为细胞在体外提供一个与生物体内相似的三维环境，使得细胞研究更加方便。另外，在微载体上培养的细胞可以非常方便地植入体内，且微载体修复缺失或受损的组织的能力已经通过实验和临床研究得以证实。目前，微载体可用于多种细胞的培养，包括成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞以及干细胞等。然而大多数用于制备微载体的材料成本高昂，制备方法复杂繁琐，且在生物相容性和可降解性方面表现有待提升，故而限制了微载体在临床中的应用。

禽类蛋清作为一种天然的蛋白质来源，很早以前就受到了食品工业和医疗领域的广泛关注，例如利用蛋清进行创伤修复和疫苗制造等。以鸡蛋清为例，鸡蛋清中所含的蛋白质可分属于不同的几类蛋白质家族，包括丝酶抑制蛋白、转铁蛋白、Kazal型蛋白酶抑制剂、糖基水解酶、脂质运载蛋白、细菌增渗蛋白、丛生蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、VMO-1蛋白以及uPAR/CD59/Ly6/蛇神经毒素叶酸接收器。鸡蛋清中主要的蛋白质包括：卵清蛋白、卵铁传递蛋白/伴清蛋白、卵类黏蛋白以及卵黏蛋白；其他蛋白质包括：溶菌酶、卵抑制剂、卵巨球蛋白/卵固蛋白、胱抑素以及亲和素。禽类蛋清虽不能自动进行降解，但由于蛋清可看作一种广义的蛋白质，在其进入人体后可被相关的蛋白酶水解，最终被人体吸收，故而亦可称为“可降解”材料。蛋清具有优良的生物相容性、生物功能性以及其无毒、可降解的特性，故而蛋清是一种制备细胞微载体的理想材料，同时，其在生物医用材料领域也具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种基于蛋清的细胞微载体及其制备方法，其制备过程简单，尺寸可控，均一性及重复性良好，同时具有良好的生物相容性、功能性和可降解性。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

其特征在于所述蛋清微载体首先通过微流控装置乳化蛋清溶液获得蛋清液滴模板，再利用化学或物理方法将模板固化获得。蛋清微载体可通过冷冻干燥等后续处理赋予其多孔结构。蛋清微载体独特的生物高分子组成及多孔结构使其成为优良的细胞培养微载体。微球进入人体后可被蛋白酶水解，从而满足对于微载体可降解性的要求。

本发明的另一目的在于提供一种基于蛋清的细胞微载体及其制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)蛋清的提取：

对所选蛋类表面进行彻底清洗，用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，对分离得到的蛋清进行过滤，取滤出的蛋清稀溶液备用；

(2)蛋清乳液的制备：

利用微流控装置及蛋清稀溶液制备粒径可控、大小均一的蛋清乳液；

(3)蛋清乳液的固化：

通过化学或物理方法对蛋清乳液进行固化，清洗后即可得到蛋清微载体；

(4)蛋清微载体多孔结构的获得：

通过对固化的蛋清微载体进行冷冻干燥，即可赋予蛋清微载体特征性的多孔结构。

(5)利用制备的蛋清微载体进行细胞培养：

对制备的蛋清微载体表面进行彻底清洗后将微载体依次浸泡于PBS缓冲液、细胞培养液中各2h，而后将细胞接种于微载体上进行三维细胞培养，3天后可观察到细胞长满整个微载体。

优选的，步骤(1)中所述的蛋清可取自鸡、鸭、鹅、鹌鹑等各种禽类或鸟类的蛋卵。

优选的，步骤(2)中所述由微流控技术制得的蛋清乳液尺寸介于20μm-5mm之间。

优选的，步骤(3)中所述的蛋清乳液的固化方法可为加热、紫外照射、强酸碱、酒精等各种可使蛋白质变性的物理或化学方法。

优选的，步骤(4)中所述通过冷冻干燥可赋予蛋清微载体多孔结构，其孔洞大小可由蛋清的浓度、蛋清的种类、冷冻干燥的时间等因素控制。

优选的，步骤(5)中所述接种于微载体上进行三维细胞培养的细胞可为HepG2细胞、3T3细胞。

本发明一种基于蛋清的细胞微载体及其制备方法包括前期蛋清的提取，利用提取的蛋清稀溶液进行蛋清乳液的制备，收集后对乳液进行固化和清洗，即可得到蛋清微载体，而通过冷冻干燥可赋予蛋清微载体多孔结构，该微载体能符合细胞微载体的要求，可进行三维细胞培养。所述方法包括以下步骤：

(1)蛋清的提取：

对所选蛋类表面进行彻底清洗，用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，对分离得到的蛋清进行过滤，取滤出的蛋清稀溶液备用；

(2)蛋清乳液的制备：

利用微流控装置及蛋清稀溶液制备粒径可控、大小均一的蛋清乳液；

(3)蛋清乳液的固化：

通过化学或物理方法对蛋清乳液进行固化，清洗后即可得到蛋清微载体；

(4)蛋清微载体多孔结构的获得：

通过对固化的蛋清微载体进行冷冻干燥，即可赋予蛋清微载体特征性的多孔结构。

(5)利用制备的蛋清微载体进行细胞培养：

对制备的蛋清微载体表面进行彻底清洗后将微载体依次浸泡于PBS缓冲液、细胞培养液中各2h，而后将细胞接种于微载体上进行三维细胞培养，3天后可观察到细胞长满整个微载体。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明一种基于蛋清的细胞微载体，微球主要成分为禽类或鸟类蛋清，蛋清无毒，具有良好的生物相容性和功能性，可进行三维细胞培养，同时由于蛋清可视为一种广义蛋白质，进入人体后可被蛋白酶水解，最后被人体吸收，故而可将其看作可降解材料，因此，蛋清是一种制备细胞微载体的理想材料，同时蛋清在生物医用材料领域亦有广阔应用前景。

本发明蛋清微载体作为一种单乳液微球，具有制备方法简单、材料易得、成本低廉、易于规模化生产等特点，有利于蛋清细胞微载体在临床中的应用。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为利用微流控装置制备蛋清乳液的示意图；

图2为对收集的蛋清乳液进行固化以及赋予蛋清微球多孔结构的流程图；

图3为HepG2细胞在蛋清细胞微载体上生长的实例图，比例尺为100μm。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1一种基于鸡蛋清的细胞微载体制备方法

1.鸡蛋清的提取：用70％酒精对新鲜鸡蛋表面进行彻底清洗，之后用分蛋器将鸡蛋清与鸡蛋黄分离，将分离出的鸡蛋清用纱布进行过滤，取滤出的鸡蛋清稀溶液备用。

2.鸡蛋清乳液的制备：制备鸡蛋清微球的微流控装置材料为硼硅酸盐，内相即非连续相材料为滤出的鸡蛋清稀溶液，外相即连续相材料为浸出型大豆油。利用稳定的液体流速(内相流速 0.5mL/h)和剪切力(外相流速 5mL/h)，连续相大豆油(油相)将非连续相鸡蛋清(水相)相切成尺寸均一的油包水单乳液结构，然后乳液通过收集管注入装满大豆油的收集池中。

3.鸡蛋清乳液的固化：将收集池置于磁力搅拌加热器上，加热至90℃，鸡蛋清乳液受热发生变性固化成鸡蛋清微球。待收集池冷却后，将鸡蛋清微球吸出，并依次用丙酮、无水酒精对其进行彻底清洗，以去除表面残留的大豆油，即得到鸡蛋清细胞微载体。测定粒径为200μm，pdi为1.5％。

4.鸡蛋清微载体多孔结构的获得：将清洗后未进行细胞培养的微载体置于无菌水中浸泡，2h后吸干无菌水，将微载体置于-80℃冰箱中冷冻30min，之后取出微载体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，过夜后即可获得具有多孔结构的鸡蛋清微载体。

5.利用微载体进行细胞培养：依次用PBS磷酸缓冲液、细胞培养液浸泡彻底清洗的蛋清微球2h，之后将HepG2细胞接种于鸡蛋清微载体上，3天后观察微载体上细胞生长情况。

实例2一种基于鸭蛋清的细胞微载体制备方法

1.鸭蛋清的提取：用70％酒精对新鲜鸭蛋表面进行彻底清洗，之后用分蛋器将鸭蛋清与鸭蛋黄分离，将分离出的鸭蛋清用纱布进行过滤，取滤出的鸭蛋清稀溶液备用。

2.鸭蛋清乳液的制备：制备鸭蛋清微球的微流控装置材料为硼硅酸盐，内相即非连续相材料为滤出的鸭蛋清稀溶液，外相即连续相材料为100cs甲基硅油。利用稳定的液体流速(内相流速 0.2mL/h)和剪切力(外相流速 2mL/h)，连续相甲基硅油(油相)将非连续相鸭蛋清(水相)相切成尺寸均一的油包水单乳液结构，然后乳液通过收集管注入装满甲基硅油的收集池中。

3.鸭蛋清乳液的固化：对收集池进行30min紫外照射，鸭蛋清乳液在紫外线照射下发生变性固化成鸭蛋清微球。之后将鸭蛋清微球吸出，并依次用正己烷、无水酒精对其进行彻底清洗，以去除表面残留的甲基硅油，即可得到鸭蛋清细胞微载体，测定粒径为500μm，pdi为1.9％。

4.鸭蛋清微载体多孔结构的获得：首先对已用于细胞培养的微载体用细胞固定液对细胞进行固定，之后用无菌水对微载体进行清洗，以去除微载体表面残留的培养基和PBS缓冲液。然后用液氮对清洗完成的微载体进行速冻，速冻后立即置于冷冻干燥机中，过夜后取出，通过扫面电子显微镜即可观察到细胞生长于鸭蛋清微载体的多孔结构中。

5.利用微载体进行细胞培养：依次用PBS磷酸缓冲液、细胞培养液浸泡彻底清洗的蛋清微球2h，之后将3T3细胞接种于鸭蛋清微载体上，3天后观察微载体上细胞生长情况。

实例3一种基于鹌鹑蛋的细胞微载体制备方法

1.鹌鹑蛋清的提取：用70％酒精对新鲜鹌鹑蛋表面进行彻底清洗，之后用分蛋器将鹌鹑蛋清与鹌鹑蛋黄分离，将分离出的鹌鹑蛋清用纱布进行过滤，取滤出的鹌鹑蛋清稀溶液备用。

2.鹌鹑蛋清乳液的制备：用液氮速冻滤出的鹌鹑蛋清稀溶液，之后迅速地将速冻的鹌鹑蛋清置于冷冻干燥机中，过夜可制得鹌鹑蛋清粉末。将制得的鹌鹑蛋清粉末用2M醋酸溶解(6％，W/V)作为内相即非连续相材料。外相即连续相材料为浸出型大豆油。利用稳定的液体流速(内相流速 0.3mL/h)和剪切力(外相流速 3mL/h)，连续相大豆油(油相)将非连续相鹌鹑蛋清粉末溶液(水相)相切成尺寸均一的油包水单乳液结构，然后乳液通过收集管注入装满大豆油的收集池中。

3.鹌鹑蛋清乳液的固化：将收集池置于4℃冰箱中24h，由于醋酸对于蛋白质的变性作用，即可固化鹌鹑蛋清乳液。将鹌鹑蛋清微球吸出，并用无水酒精对其进行彻底清洗，以去除表面残留的大豆油，即可得到鹌鹑蛋清细胞微载体，测定粒径为250μm，pdi为2.0％。

4.鹌鹑蛋清微载体多孔结构的获得：将清洗后未进行细胞培养的微载体置于无菌水中浸泡，2h后吸干无菌水，将微载体置于-80℃冰箱中冷冻30min，之后取出微载体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，过夜后即可获得具有多孔结构的鹌鹑蛋清微载体。

5.利用微载体进行细胞培养：依次用PBS磷酸缓冲液、细胞培养液浸泡彻底清洗的蛋清微球2h，之后将HepG2细胞接种于鹌鹑蛋清微载体上，3天后观察微载体上细胞生长情况。