一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法与流程

本发明属于植物病原微生物领域，涉及一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法。

背景技术：

币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa F.T.Bennett)是草坪草上一种重要的植物病原真菌，它可以侵染几乎所有冷季型、暖季型草坪草以及其它部分禾本科植物。1932年，由该病菌侵染造成的币斑病首次在美国报道，目前币斑病菌已在世界范围内分布广泛。在我国，币斑病菌已出现在20多个省区多种草坪草上。币斑病主要有初夏和初秋两个发病高峰期，当土壤温度高于18℃、夜间湿度较大时币斑病开始发病，发病初期在草坪上形成约硬币大小的近圆形病斑，严重时，斑块可连接成大片的枯草区，严重影响草坪景观。

币斑病菌菌丝生长旺盛，在适合的条件下，主要通过菌丝侵染的方式在寄主草坪草个体间迅速定殖并传播。现有技术中一般是采用PDA来培养币斑病菌，病原菌在培养基上培养时由于培养基给病原菌提供大量的糖，从而导致菌体中多糖含量较高，且不同菌株之间产多糖水平存在差异，而多糖含量高低直接影响基因组DNA提取效率。采用常规的DNA提取方法或市场上常用的试剂盒提取币斑病菌基因组DNA时，常因菌丝组织中大量的多糖存在，严重影响DNA的得率，而一些去除多糖的方法也很难把币斑病菌DNA提取过程中的多糖与目标DNA进行有效的分离。导致在进行后续的分子生物学相关实验，特别是在进行群体生物学或基因组学相关的研究时，常常因为很难获得稳定且较好质量的基因组DNA，而严重影响试验的进展。如何获取稳定、均一且高质量的币斑病菌基因组DNA成为很多进行币斑病菌相关研究人员面临的难题。因此开发一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法是进行相关研究的必要前提条件。

技术实现要素：

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种提高币斑病菌DNA提取质量的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供的技术方案如下：

一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，包括如下步骤：

步骤(1)、菌丝培养：培养皿中加入含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺设灭菌玻璃纸，使用接种针挑取病原菌菌丝转移至培养基中间，25-30℃黑暗条件培养7-14d；

步骤(2)、菌丝准备：使用灭菌解剖刀刮取玻璃纸表面菌丝20-50mg置于离心管中，置于通风处室温通风干燥12-18h，往离心管中加入钢珠，使用液氮冷冻、粉碎机磨碎菌丝用于DNA提取；

步骤(3)、DNA提取：采用经典CTAB法提取得到基因组DNA，将基因组DNA溶解于TE缓冲液，静置24-48h，离心，去除不溶于TE缓冲液的杂质(包括蛋白、剩余多糖等)，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测。

作为本发明提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法的优选方案，还包括：ITS扩增：以基因组DNA为模板，采用通用引物对病原菌ITS区域进行扩增，使用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测以检验基因组DNA提取效果。

步骤(1)中，所述的含有抗生素的MM培养基的制备方法为：称取葡萄糖10g，K2HPO41.5g，KH2PO4 2g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母浸粉2g，琼脂粉15g，加入去离子水溶解并定容到1L，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，加入氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素，使氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素的终浓度均为50mg/L。使用基本培养基(Minimum medium,MM)用于币斑病菌菌丝的培养，仅能满足币斑病菌基本生长需求，可达到降低菌丝中多糖含量的目的。

培养皿中加入MM培养基的体积需严格控制，直径为6cm的培养皿加入MM培养基的体积2-3ml，直径为9cm的培养皿加入MM培养基的体积5-7ml，以正好可以覆盖培养皿底为准，培养基的厚度约为1-2mm，培养皿中培养基过厚时会提高菌丝中多糖含量而影响DNA得率。

在25-30℃黑暗条件培养7-14d，在该培养温度下菌丝生长量可满足后续DNA提取要求，且DNA提取得率较高；培养时间越长DNA提取的得率越高，培养7-14天均可有效提出基因组DNA。

步骤(2)中，用于DNA提取的菌丝质量20-50mg之间最佳，质量过高反而会影响DNA提取的得率；所述的通风处可以采用通风厨或者风扇，菌丝使用通风厨或风扇通风干燥，干燥时间以12-18h为宜，可使菌丝中的水分大大降低，有利于菌丝组织研磨的彻底。

步骤(3)中，基因组DNA提取的具体方法为：按照质量体积比1-2.5mg：25μl，往病原菌菌丝中加入CTAB提取缓冲液，于65℃水浴30min，每隔10-15min混匀1次；加入与CTAB提取缓冲液等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)轻轻混匀，12000-13500rpm离心5-10min；取上清液于新的离心管中，加入0.6倍上清液体积的预冷异丙醇(4℃)，充分混合后室温(20～30℃)静置用于沉淀基因组DNA，12000-13500rpm离心1min后弃去上清液；沉淀用70％冷乙醇(4℃)洗涤1遍，65℃干燥5-10min后溶于TE缓冲液中，室温(20～30℃)静置24-48h，于-20℃保存。

所述的CTAB提取缓冲液为：2％CTAB；100mmol/l Tris-HCl，pH 8.0；20mmol/l EDTA，pH 8.0；1.4mol/l NaCl。

所述的TE缓冲液为：10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH8.0。

本发明中20-50mg币斑病菌菌丝提取出的基因组DNA溶于100μl TE缓冲液中。

所述的基因组DNA溶解于100μl TE缓冲液后，需室温静置24-48h以达到DNA充分溶解的目的，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测前需要12000rpm离心1min以提高DNA的纯度。

本发明所述的病原菌为草坪币斑病菌。

本发明方法同样适用于提取其他高多糖含量的病原真菌的基因组DNA。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过改变用于币斑病菌菌丝培养的培养基，以及控制病原菌菌丝培养条件及培养时间，同时结合常规的菌丝研磨和DNA提取方法，从而达到提高基因组DNA提取得率、质量及稳定性，降低DNA提取费用的目的。具体表现为：

(1)本发明简单易行，无需借助专用的仪器设备或DNA提取试剂盒，无需特殊或昂贵的药品和试剂，常规分子生物学实验室就可完成，大大降低了成本。

(2)本发明提取的币斑病菌基因组DNA无论在得率、质量还是稳定性方面均优于常规的币斑病菌DNA提取方法，大大提高了DNA提取成功效率。

(3)本发明在对菌丝培养条件进行改进，通过降低菌丝中多糖含量以达到提高DNA提取质量，使后续借助PCR扩增的分子生物学相关实验过程更加流畅和容易，且这种方法改进不会增加额外的成本。

(4)本发明所提供的通过改变培养基质降低菌丝多糖含量以提高DNA提取质量的思路具有应用于其它高多糖含量真菌基因组DNA提取中的潜力。

附图说明

图1为通过本发明方法获得的不同来源币斑病菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。

图2为通过常规方法获得的不同来源币斑病菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。

图3为在不同培养基体积及不同培养时间条件下同一来源币斑病菌基因组DNA提取效果比较。A为培养7天，B为培养14天。

图4为以本发明方法获得的币斑病菌DNA为模板进行ITS扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。

图5为以常规方法获得的币斑病菌DNA为模板进行ITS扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施过程进行描述，所举实施例只用于解释本发明，而不用于限定本发明的范围。

实施例1

1、实验方法

采用本发明方法对草坪币斑病菌基因组DNA进行提取，包括如下步骤：

(1)菌丝培养：一次性培养皿(直径6cm)中加入3ml含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺设灭菌玻璃纸，使用接种针挑取草坪币斑病菌菌丝转移至培养基中间，25℃黑暗条件培养7d；

其中，所述的含有抗生素的MM培养基的制备方法为：称取葡萄糖10g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 2g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母浸粉2g，琼脂粉15g，加入去离子水溶解并定容到1L，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，加入氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素，使氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素的终浓度均为50mg/L；

(2)菌丝准备：使用灭菌解剖刀刮取玻璃纸表面菌丝40mg置于2ml离心管中，通风干燥菌丝12-18h，往离心管中加入钢珠(直径4mm)，使用液氮冷冻、粉碎机磨碎菌丝用于DNA提取；

(3)DNA提取：采用CTAB法并稍做改动提取基因组DNA，改动部分为：DNA溶解于100μl TE缓冲液24-48h并离心后，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测；具体步骤如下：

a、往磨碎的菌丝中加入500μl CTAB提取缓冲液(2％CTAB,100mM Tris-HCl pH 8.0,20mM EDTA pH 8.0,1.4M NaCl)，于65℃水浴30min，中间混匀2-3次；

b、加入与CTAB提取缓冲液等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(v/v/v，25：24：1)轻轻混匀，13500rpm离心5min；

c、取500μl上清液于新的1.5ml离心管中，加入300μl 4℃预冷异丙醇，充分混合后室温静置10min用于沉淀基因组DNA，12000rpm离心1min后弃上清；

d、沉淀用400μl 4℃70％(体积分数)冷乙醇洗涤1遍，65℃干燥5-10min；

e、基因组DNA溶于100μl TE缓冲液中(10mmol/l Tris-HCl,1mmol/l EDTA,pH8.0)，室温静置24-48h后于-20℃长期保存备用；

(4)DNA检测：将前一步溶有基因组DNA的TE缓冲液于12000rpm离心1min后，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测，结果见图1。

(5)病原菌ITS扩增：将步骤(4)获得的病原菌基因组DNA用于ITS的PCR扩增：

①ITS序列扩增引物：ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，预期扩增片段长度为600bp；

②PCR扩增反应体系：25μl反应体系含有2.5μL 10×Taq Buffer，1μl模板DNA，0.4mM dNTPs，1.25mM MgCl2，0.5μM ITS1F和ITS4 0.5U Taq Polymerase；

③PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后进入循环，即95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，共35个循环扩增反应；

④电泳检测：吸取3μl PCR产物，在1％的琼脂凝胶上进行电泳检测，结果见图3。

2、实验结果

实验结果显示，采用本发明的改进方法获得币斑病菌菌丝用于DNA提取时，DNA提取质量显著提高，不同菌株的DNA均可以有效提出，DNA提取的稳定性明显提高，即针对不同来源币斑病菌均能有效提出其基因组DNA(图1)，发明人采用该方法已有效提出150余株币斑病菌基因组DNA，表明该方法的稳定性较高。

此外，考察不同培养基体积(培养基体积调整为2、3、5ml)和不同培养时间对基因组DNA的影响，如图3所示，不同培养基体积及培养时间对基因组DNA存在一定程度的影响，币斑病菌在培养时间为7d，培养基体积为2ml时，基因组DNA提取得率最大，而在培养时间为14d，培养基体积为3ml时，基因组DNA提取得率最大，因此，本发明采用的培养基体积为2-3ml，培养时间为7-14d。

最后采用改进的方法提取基因组DNA进行PCR扩增所得产物凝胶电泳显示清晰(图4)，表明该方法获得的币斑病菌基因组DNA可满足常规的PCR扩增需求。

实施例2

1、实验方法

采用传统方法对草坪币斑病菌基因组DNA进行提取，包括如下步骤：

(1)菌丝培养：一次性培养皿(直径6cm)中加入3ml含有抗生素的马铃薯琼脂培养基(Potato dextrose agar,PDA)，PDA表面铺设灭菌玻璃纸，使用接种针挑取币斑病菌菌丝转移至培养基中间，25℃黑暗条件培养7d；

(3)菌丝准备：使用灭菌解剖刀刮取玻璃纸表面菌丝40mg置于装有液氮的研钵中进行粉碎，将粉碎的菌丝收集到2ml离心管中用于DNA的提取；

(4)DNA提取：采用实施例1中的CTAB提取方法或Qiagen Dneasy Plant Mini Kit试剂盒提取币斑病菌基因组DNA，试剂盒提取具体步骤参照使用说明；

(5)DNA检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测。

(6)病原菌ITS扩增：同实施例1。

2、实验结果

实验结果显示，采用常规方法获得币斑病菌菌丝用于DNA提取时，DNA得率较低，有的菌株甚至无法有效提出DNA，稳定性差(图2)，对100株币斑病菌基因组DNA进行提取，仅15株可以有效提取，且DNA浓度较低。同时提取的基因组DNA影响后续ITS扩增结果(图5)。

本领域技术人员应该清楚，只要使用具有相应致病性的且鉴定为币斑病菌的真菌，均适用于本发明。

<110>南京农业大学

<120>一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法

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<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

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<223> ITS4

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tcctccgctt attgatatgc 20

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<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

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<223> ITS1F

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