一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及利用方法构建mRNA过表达模型与流程

本发明属于基因编辑技术领域，具体说一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及利用该方法构建mrna过表达模型。

背景技术：

海水养殖业是蓝色农业的重要组成部分。如何获得更多更优质的海水养殖品种一直是国内外科学家致力于研究的重要内容。同时，社会经济的发展，对产品多样化的需求也对海洋生物种质改良提出了更高要求。以对虾为例，对虾是我国海水养殖的重要品种，在海洋渔业中占有重要地位。我国科学家通过传统选育的方法，已育出了中国对虾“黄海1号”、“黄海2号”，凡纳滨对虾“科海1号”等新品种，而且部分新品种已实现产业化。但常规选育方法周期长、见效慢；近年来发展起来的依靠生产性状关键基因的定向、快捷的分子育种技术将是生物制种未来的发展方向。目前，对虾全基因组测序工作也在进行中，大量的对虾功能基因已经和正在被发掘出来，深入分析这些基因的功能从而阐明其与生产性状的关系，可以为育种关键基因的选择与评价提供可靠依据。尽管生物信息学可以对基因功能进行预测，但是受到细胞系及转基因技术瓶颈的限制，虾类功能基因的实验生物学研究也仅仅停留在基因水平(基因表达图示技术、定量技术、基因定位等)和蛋白水平(体外重组表达、westernblot、免疫组织化学、蛋白-蛋白相互作用以及蛋白-dna相互作用等)上。

转基因技术则是基因功能验证技术体系中非常重要的一环，而且也属于新型的现代分子育种技术。而胚胎的显微注射是转基因研究中的重要实验操作。通过显微注射的方式，可以将一系列的外源物质导入到细胞或胚胎中；通过显微注射的方式，也可以对胚胎进行基因敲减与基因编辑从而对功能基因等进行研究。然而，对于虾类等十足目生物，其功能基因的研究手段相当匮乏。这使得显微注射技术在虾类胚胎中的应用显得尤为关键。

脊尾白虾(exopalaemoncarinicauda)，属于甲壳动物亚门十足目(decapoda)，是一种经济价值较高的海产虾类。脊尾白虾对环境适应性强，易于人工饲养。同时，其繁殖能力强，雌虾可连续产卵。根据以上优点，脊尾白虾e.carinicauda可作为新的甲壳动物研究模型，尤其是针对十足目这一经济甲壳物种，用于揭示这一类物种发育、生长、代谢与繁殖等生命活动规律。但是该虾类一直缺乏有效的外源物质导入平台，所以脊尾白虾胚胎显微注射平台的构建具有重要意义。

另外，绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，egfp)，是一种在蓝色到紫外线波长范围光线下，能被激发出绿色荧光的蛋白。因为egfp这一光学特性也使得其经常被作为一个报告基因应用于生物的细胞学与分子生物学等研究中。

技术实现要素：

本发明目的在于解决甲壳动物基因编辑研究匮乏的问题，提供一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及其利用方法构建体外转录模型。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种脊尾白虾胚胎显微注射方法，将高渗透压的显微注射体系在特定的显微注射条件下向脊尾白虾单细胞时期(8细胞之前)胚胎进行显微注射。

所述高渗透压的显微注射体系为显微注射缓冲液和显微注射液其中，显微注射缓冲液：无酶水配制的终浓度为100mmhepes和1.5mnacl溶液；

显微注射液为注射材料和指示剂；其中，注射材料为经无酶水稀释的体外转录egfpmrna，mrna稀释至400ng/μl；指示剂为酚红溶液。

上述显微注射后脊尾白虾单细胞时期(8细胞之前)胚胎在显微注射高渗液中。所述显微注射高渗液为用新鲜海水配制的5％的聚蔗糖ficoll400。

所述显微注射条件为压强为80pa；显微注射的量为0.5nl；显微注射的时间为0.7s；显微注射后的受精卵培养环境为离体孵育在经0.22μm滤膜抽滤的新鲜海水中。

一种脊尾白虾胚胎显微注射方法构建体外转录模型，以体外转录mrna作为注射材料，采用所述脊尾白虾胚胎显微注射方法，构建体外过表达mrna的脊尾白虾模型。

具体地说,以体外转录合成的egfpmrna作为注射材料，采用所述脊尾白虾胚胎显微注射方法，构建体外过表达egfpmrna的脊尾白虾模型。

本发明所具有的优点：本发明建立了一种脊尾白虾胚胎显微注射方法，并利用显微注射方法成功实现了体外转录合成的egfpmrna在脊尾白虾受精卵中的表达，为虾类等甲壳动物功能基因的研究提供重要研究手段。具体的说本发明脊尾白虾受精卵胚胎显微注射方法对于开展脊尾白虾基因的过表达以及脊尾白虾基因组的编辑等都具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1为本发明实施例提供的体外转录合成的egfpmrna检测结果。

图2为本发明实施例提供的egfpmrna显微注射后胚胎的荧光检测结果；其中a，b，c和d为未注射对照组；e，f，g和h为egfpmrna注射实验组。a，c，e和g为暗视场下成像图片；b，d，f和h为蓝光激发下的荧光成像。a，b，e和f为4倍物镜下成像图片，其黑色标尺为500μm；c，d，g和h为10倍物镜下采集图片，黑色标尺为200μm。

具体实施方式

下面实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：脊尾白虾胚胎显微注射方法

1)脊尾白虾及受精卵的选择

在显微注射实验中，所用虾为健康的成体脊尾白虾(e.carinicauda)，平均体长为5.5±0.5cm。实验所用虾在自然海水中连续充气培养，每天换水并投喂饵料，水温维持在24℃，挑选性腺发育成熟的脊尾白虾用于实验。根据脊尾白虾受精卵各个发育时期的特点，结合显微注射实验成功率，8细胞期前注射成功率较高，其中单细胞期的注射成活率最高；8细胞期后注射困难，注射针易于折断；所以，选择单细胞时期的受精卵为显微注射所用虾卵的最佳选择。

2)显微注射体系中相关因素的优化

显微注射体系中涉及到显微注射缓冲液：脊尾白虾受精卵内部是稳定的环境，其自身只有很小范围的调控能力，所以用来显微注射的各个成分必须依赖缓冲液的调节以维持在与受精卵内部环境相近的ph范围内，本发明选择在近中性ph具有较强缓冲能力的hepes缓冲溶液，通过添加一定浓度的nacl以维持注射后胚胎内具有较高的渗透液压；显微注射液：用以显微注射的各个成分及显微注射指示液的混合物，经对不同浓度的egfpmrna进行显微注射，结果发现400ng/μl的egfpmrna具有较好的效果；显微注射高渗液：脊尾白虾受精卵显微注射之后为防止卵内容物过多流失，需将其放置于高渗液中以维持，并在不超过3h的时间内转移至经0.22μm滤膜抽滤的新鲜海水中摇床孵育。

高渗透压的显微注射体系为显微注射缓冲液和显微注射液；

(1)显微注射缓冲液：无酶水配制含终浓度为100mmhepes和1.5mnacl的溶液。

(2)显微注射液：用无酶水将合成的egfpmrna浓度稀释至400ng/μl获得egfpmrna溶液，并添加终浓度为0.5％的酚红(质量浓度)作为指示剂。

将上述获得egfpmrna溶液中加入其0.1倍体积的上述(1)显微注射缓冲液，并添加终浓度为0.5％的酚红(质量浓度)作为指示剂，进而获得高渗透压的显微注射体系

(3)显微注射高渗液：新鲜海水配制质量浓度为5％的聚蔗糖ficoll400。

3)显微注射条件的选择

显微注射的相关条件包括显微注射时选择的压强：压强不应超过80pa，否则会冲乱受精卵内部的物质排列；显微注射的量：显微注射进入受精卵的量应该适中，过少不足以进行基因编辑，过多又对受精卵产生毒害作用，本发明采用注射量为0.5nl；显微注射的时间：显微注射的时间与显微注射的量存在正相关关系，因此为了保证一定的显微注射量，显微注射的时间不应超过0.7s；显微注射后的受精卵培养环境：离体孵育在经0.22μm滤膜抽滤的新鲜海水中。

实施例2：采用脊尾白虾胚胎显微注射方法构建模型

(1)sp6-egfpdna模板的构建

将egfp序列插入商品化质粒pizt/v5-his(invitrogen,usa)的多克隆位点ecori和noti之间，构建pizt/v5-egfp重组质粒。并根据pizt/v5-egfp的序列设计正向引物sp6-egfp-f与反向引物sp6-egfp-r,在正向引物中加入sp6启动子位点。

引物序列如下：

sp6-egfp-f：gcatttaggtgacactatagaaacagatggtgagcaagggcgagga(单下划线为sp6启动子序列)

sp6-egfp-r：cgcgcttgaaaggagtgtgta

利用引物sp6-egfp-f与sp6-egfp-r扩增pdhsp70-egfp-his质粒中的egfp序列，pcr反应体系为：

pcr循环程序如：98℃预变性1min；98℃10sec，59℃5sec，72℃20sec，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测sp6-egfp扩增片段大小后，pcr产物直接测序，得到测序正确的sp6-egfp片段用于egfpmrna的体外转录。

(2)egfpmrna的体外转录与纯化

根据sp6mmessagekit(ambion)说明书，以所得sp6-egfpdna片段进行egfpmrna的体外转录，体外转录体系如下：

37℃孵育2hr后；加入1μlturbodnase与37℃孵育15min，除去dna模板，使用酚/氯仿抽提与异丙醇沉淀方式对转录得到的mrna进行纯化，用1％的琼脂糖凝胶检测合成的mrna是否完整，结果如图1所示。

(3)egfpmrna的显微注射

用无酶水配制20μl显微注射液，用无酶水将上述合成的egfpmrna浓度稀释至400ng/μl，再加入2μl显微注射缓冲液，同时加入2μl的0.5％酚红作为指示剂。对脊尾白虾i细胞期胚胎进行显微注射。注射后的胚胎置于盛有无菌海水的培养皿中，在摇床上室温孵育，每天早晚更换无菌海水各一次。显微注射20h之后，荧光显微镜下观察，分别采集对照组和注射后实验组胚胎在暗视场和紫外线激发下的图像，并分析实验组是否存在绿色荧光的产生，结果如图2所示。

由图2可见，注射egfpmrna20小时后，在荧光显微镜观察结果表明在蓝光激发下，实验组相对于空白组有明显的绿色荧光发生。实验组脊尾白虾受精卵绿色荧光表明，体外合成的egfpmrna在注射到脊尾白虾受精卵后成功在其胚胎中翻译表达成为具有活性的egfp。

本发明中有效的脊尾白虾胚胎显微注射方法的建立，对于开展脊尾白虾基因的过表达以及脊尾白虾基因组的编辑等都具有非常重要的理论意义和实践意义。

sequencelisting

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及利用方法构建mrna过表达模型

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>46

<212>dna

<213>人工设计

<220>

<221>gene

<222>(1)..(46)<223>

<400>1

gcatttaggtgacactatagaaacagatggtgagcaagggcgagga46

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工设计

<220>

<221>gene

<222>(1)..(21)

<223>

<400>2

cgcgcttgaaaggagtgtgta21