一种调控甲状旁腺PTH分泌的载体及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种调控甲状旁腺pth分泌的载体及其应用。

背景技术：

甲状旁腺是内分泌系统中非常重要的腺体，其分泌的甲状旁腺素(parathyroidhormone,pth)是由甲状旁腺主细胞分泌的一种重要的钙磷稳态调节因子，在维持机体血液钙磷平衡以及骨代谢平衡过程中发挥重要作用。pth参与骨代谢调节，通过作用于成骨细胞，pth可促进骨吸收作用，将骨钙带入血液，从而提高血钙浓度。pth的整个合成分泌过程受到钙，维生素d以及生长因子共同调解，其中血钙浓度与pth浓度直接相关。当甲状旁腺自身发生病变或身体其他疾病引发的继发性增生，瘤变甚至癌变时，会引发pth合成及分泌呈爆发性增长，在血液中的浓度异常升高；这种异常升高能促进骨吸收，引发更快更严重的骨质疏松症的发生，大大提高了骨折甚至瘫痪的风险；同时，高浓度pth直接引发高血钙症，加上骨基质释放和尿液酸碱度的改变常导致反复性尿路结石，导致肾功能逐步下降，甚至肾衰和尿毒症。pth堆积引发的高血钙还可能危害身体其他多个系统，如心脏循环系统，神经肌肉运动系统，消化系统和中枢系统等，可导致血糖，血脂代谢异常和血压调节紊乱甚至神经精神疾病。

目前，治疗甲旁亢的方法主要包括药物干预和手术切除。药物干预主要包括口服磷，雌激素，拟钙剂，活性维生素d等。口服磷可降低pth引发的高血钙症，但是口服磷又会反过来引发pth的升高，因此很少被选用。服用雌激素可有效降低骨溶解，增加骨量，拮抗pth的骨吸收作用。但是雌激素作用范围广泛，特异性差，易造成细胞增生，甚至有报道称长期服用雌激素易引发妇科肿瘤及其他严重的并发症。拟钙剂是近期发现的基于调控主细胞的钙相关受体，具有模拟钙升高，负反馈抑制pth分泌的新的潜在的治疗甲旁亢的药物；但是该药物尚处于研发阶段，尚无足够的临床数据。此外，大剂量长时间服用活性维生素d可抑制pth分泌，但是常引发高血磷症状。综合来看，现有的药物干预甲旁亢因为特异性差，作用范围广，易引发并发症的缺点，目前并没有特别有效的药物干预手段。目前临床上常用的治疗手段是甲状旁腺切除并行自体移植术，因移植的组织不受机体的神经支配，因此短期内会发生pth分泌节律紊乱，浓度依然可能会出现高于正常值的情况，但甲状旁腺全切除会导致骤发性低血钙症，需要实施自体甲状旁腺组织移植术以维持血钙浓度稳定，移植后的pth浓度难以控制，且存在一定的瘤化风险。

由于常用的药物特异性差，作用效果不明显，目前临床上主要的治疗手段是甲状旁腺切除并行自体移植术，因移植的组织不受到神经支配，因此短期内会发生pth分泌节律紊乱，浓度可能依然会高于正常值。如果能找到一种特异性抑制甲状旁腺主细胞的pth分泌的方法，那么即可原位在体或移植后调控甲状旁腺组织，抑制pth的异常分泌，有效降低高血钙导致的一系列症状。

光遗传调控技术是本世纪初出现的，快速发展的一种新兴技术；其原理是基于基因治疗的方法给哺乳动物细胞转入不同的光敏基因，通过不同波长的光对特定细胞类型活性进行调控。在光遗传技术出现之初，该技术主要被应用于神经科学领域，集中在对神经元活性的调节；随着技术的进步和推广，该技术逐渐被应用于其他领域的研究，如：光基因调控心肌细胞，光遗传学技术调控胰岛素分泌等。但迄今为止，尚未见到光遗传技术调控甲状旁腺主细胞的报道。

综上所述，研发一种基于高时空选择性和细胞特异性的调控载体及相关技术用于内分泌腺体细胞功能的调节具有广阔的市场价值和应用前景。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种调节甲状旁腺pth分泌的载体及其应用，所述载体携带光敏基因和特异性识别甲状旁腺的pth启动子，将所述载体用于制备药物并和特定频率和波长的蓝光组成调节甲状旁腺的体系，通过pth启动子靶向识别甲状旁腺，特定频率和波长的蓝光刺激调控光敏基因，达到高时空高精度特异性调节甲状旁腺素分泌的功能，具有广阔的应用前景和市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种调控甲状旁腺pth分泌的载体，所述载体包括光敏基因和/或特异性识别甲状旁腺主细胞的pth启动子；

所述pth启动子的核酸序列如seqidno:1所示，所述seqidno:1所示的核酸序列如下：

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所述光敏基因是一种能表达对蓝光敏感的细胞膜通道蛋白的基因，光敏蛋白在特定波长(如470nm)照射下可以开放通道，使阳离子(钠离子，钙离子等)进入细胞质，致使细胞膜电位上升，从而实现对细胞的活性调控。光遗传调控技术是通过给哺乳动物细胞转入不同的光敏基因，通过不同波长的光对特定细胞类型活性进行调控。

本发明在充分研究对甲状旁腺调节的现有技术后，总结各自优缺点，为了规避药物作用范围过广、特异性差、效果不明显的弊端和手术切除后pth分泌紊乱的问题，创造性地选用光遗传学调控技术，利用特异性的启动子，能特异性识别甲状旁腺主细胞的pth启动子，识别甲状旁腺主细胞，通过特定波长和频率的蓝光照射来调控甲状旁腺主细胞的pth分泌，达到高时空精确特意性调节甲状旁腺主细胞的目的。

优选地，所述光敏基因为chr2，所述chr2的核酸序列如seqidno:2所示，所述seqidno:2所示的核酸序列如下：

atggactatggcggcgctttgtctgccgtcggacgcgaacttttgttcgttactaatcctgtggtggtgaacgggtccgtcctggtccctgaggatcaatgttactgtgccggatggattgaatctcgcggcacgaacggcgctcagaccgcgtcaaatgtcctgcagtggcttgcagcaggattcagcattttgctgctgatgttctatgcctaccaaacctggaaatctacatgcggctgggaggagatctatgtgtgcgccattgaaatggttaaggtgattctcgagttcttttttgagtttaagaatccctctatgctctaccttgccacaggacaccgggtgcagtggctgcgctatgcagagtggctgctcacttgtcctgtcatccttatccgcctgagcaacctcaccggcctgagcaacgactacagcaggagaaccatgggactccttgtctcagacatcgggactatcgtgtggggggctaccagcgccatggcaaccggctatgttaaagtcatcttcttttgtcttggattgtgctatggcgcgaacacattttttcacgccgccaaagcatatatcgagggttatcatactgtgccaaagggtcggtgccgccaggtcgtgaccggcatggcatggctgtttttcgtgagctggggtatgttcccaattctcttcattttggggcccgaaggttttggcgtcctgagcgtctatggctccaccgtaggtcacacgattattgatctgatgagtaaaaattgttgggggttgttgggacactacctgcgcgtcctgatccacgagcacatattgattcacggagatatccgcaaaaccaccaaactgaacatcggcggaacggagatcgaggtcgagactctcgtcgaagacgaagccgaggccggagccgtgccagcggccgcc；

本发明中，所述chr2(channelrhodopsin-2)编码阳离子通道蛋白，470nm波长的蓝光光照后使阳离子进入细胞，而兴奋细胞活性；利用光感基因chr2的电传导性和快速动力学特性，不仅可以实现通过光来诱导神经元产生动作电位；还可以调控神经系统的兴奋性和突触的传递性。

第二方面，本发明提供一种将第一方面所述的载体与脂质体、包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组腺相关病毒；

优选地，所述脂质体包括磷酸钙、lipofectamine2000或fngene，优选为fngene。

优选地，所述哺乳细胞为293ft细胞。

优选地，所述包装辅助质粒包括paav-rc和/或phepler。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的载体用于制备调节甲状旁腺的药物。

第四方面，本发明提供一种包括第二方面所述重组腺相关病毒的药物。

第五方面，本发明提供一种包括如第四方面所述的药物和蓝光用于调节甲状旁腺的体系。

优选地，所述蓝光的波长为450-500nm，例如可以是450nm、460nm、470nm、480nm、490nm或500nm，优选为460-480nm。

优选地，所述蓝光的频率为15-25hz，例如可以是15hz、16hz、17hz、18hz、19hz、20hz、21hz、22hz、23hz、24hz或25hz，优选为18-22hz。

优选地，所述蓝光的光照平均强度为8-12mw/mm²，例如可以是8mw/mm²、9mw/mm²、10mw/mm²、11mw/mm²或12mw/mm²，优选为9-11mw/mm²。

第六方面，本发明提供一种用于非治疗目的的调节甲状旁腺的方法，包括如下步骤：

(1)构建携带cmv启动子、光敏基因和荧光基因的慢病毒；

(2)将步骤(1)所述慢病毒感染人甲状旁腺主细胞，进行验证实验；

(3)采用蓝光刺激步骤(2)感染后的细胞，收集条件培养基检测pth变化；

(4)构建第二方面所述的重组腺相关病毒并感染大鼠甲状旁腺，采用蓝光刺激甲状旁腺，收集血清，检测pth浓度、血钙及血磷浓度变化；

任选地，所述方法在步骤(3)之后还包括构建第二方面所述的腺相关病毒病感染的大鼠甲状旁腺组织，采用蓝光刺激组织，收集培养基检测pth浓度。

优选地，步骤(3)所述刺激的时间为20-40min，例如可以是20min、22min、24min、25min、26min、28min、30min、32min或35min，优选为25-35min。

优选地，步骤(4)所述感染的方法为将病毒注射大鼠甲状旁腺，每侧注射0.2-0.5微升，例如可以是0.2微升、0.3微升、0.4微升或0.5微升。

优选地，步骤(4)所述刺激的时间点为感染后18-22天，例如可以是18天、19天、20天、21天或22天。

优选地，所述检测的方法为elisa。

首先，发明人运用慢病毒(lenti-cmv-cheta-eyfp，启动子为cmv，属于广谱性启动子，可感染所有细胞，不具选择性)感染人来源的甲状旁腺主细胞，光调控后发现在细胞水平可以有效、可逆地抑制pth分泌。为实现细胞选择性，又设计了pth启动子的腺相关病毒载体，并通过包装成病毒后对大鼠的甲状旁腺进行感染，发现手术取出大鼠已表达病毒的甲状旁腺在体外刺激后可抑制其pth分泌，且功能可恢复。而直接在大鼠体内进行光刺激后，发现也可以可逆的抑制pth分泌，同时，还调节了血液中钙磷平衡。

作为优选技术方案，本发明提供一种调节甲状旁腺的方法，具体包括如下步骤：

(1)构建携带cmv启动子、光敏基因和荧光基因的慢病毒；

(2)将步骤(1)所述病毒感染人甲状旁腺主细胞，进行验证实验；

(3)采用蓝光刺激步骤(2)感染后的细胞，收集条件培养基检测pth变化；

(4)构建第二方面所述重组腺相关病毒并注射大鼠甲状旁腺，每侧注射0.2-0.5微升，感染后18-22天采用蓝光刺激的分离的甲状旁腺组织，收集培养基检测pth浓度；

(5)将步骤(4)所述重组腺相关病毒注射大鼠甲状旁腺，每侧注射0.2-0.5微升，感染后18-22天采用蓝光刺激甲状旁腺，收集血清，检测pth浓度、血钙及血磷浓度变化；

其中，步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)所述蓝光的波长为450-500nm，频率为15-25hz，光照平均强度为8-12mw/mm²，时间为20-40min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的载体能够制备重组腺病毒以及包含该重组腺病毒和蓝光的调节甲状旁腺的体系，能够高时空精确地特异性调控甲状旁腺主细胞，调节其pth的释放；这种在体特异的pth调节体系和方法，可规避药物作用范围过广，特异性差，效果不明显的弊端，可有效维持血清钙磷平衡。

附图说明

图1是本发明实施例2的原代人甲状旁腺主细胞培养系统免疫染色鉴定图，其中图1(a)为未染色的细胞图，图1(b)为pth染色图，图1(c)为casr钙离子受体染色图，图1(d)为vdr维生素d受体染色图；

图2是本发明实施例2的病毒感染细胞染色结果图，其中图2(a)为带有光敏基因的慢病毒感染细胞的荧光图，图2(b)为未带有光敏基因的慢病毒感染细胞的荧光图；

图3是本发明实施例3的实验流程图，其中图3(a)为实验步骤图，图3(b)为蓝光照射细胞实验图，图3(c)为蓝光照射细胞原理图；

图4是本发明实施例3的结果图，其中图4(a)为刺激前检测结果，图4(b)为刺激1小时后检测结果，图4(c)为刺激6小时后检测结果；

图5是本发明实施例4的实验过程图，其中图5(a)为大鼠解剖图，图5(b)为甲状旁腺表达病毒示意图，图5(c)为手术取出的大鼠甲旁腺组织示意图，图5(d)蓝光照射图；

图6是本发明实施例4的结果图，其中图6(a)为pth的柱状图，图6(b)为总蛋白的柱状图，图6(c)为raav-pth-hchr2(h134r)-mcherry-wpre-pa质粒序列图；

图7是本发明实施例5的实验过程图，其中图7(a)为大鼠解剖图，图7(b)为在体光刺激示意图，图7(c)为大鼠甲旁腺注射病毒后病毒表达示意图；

图8是本发明实施例5的结果图，其中图8(a)为pth浓度图，图8(b)为钙离子浓度图，图8(c)为磷离子浓度图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

构建并包装携带光敏感基因的cmv启动子慢病毒和pth启动子的腺相关病毒：采用三质粒法包装慢病毒(目的基因、pδ和vsvg)及腺相关病毒(目的基因、paav-rc和phelper)；以慢病毒包装为例，大体过程如下：将pδ(15μg)、vsvg(7μg)以及携带光感基因、绿色荧光基因和对应启动子的目的基因质粒(22μg)混合，利用脂质体fngene(invitrogen)一起转染至293ft细胞中进行包装，24h后换用病毒生产培养基(含有5mm丙酮酸钠的dmem)继续培养，24h后收集培养基上清1000rpm离心五分钟，取上清；0.45μm滤膜过滤细胞残渣后，将滤液转入离心管中，并在底部铺上20％的蔗糖滤柱，利用低温超高速离心机在4度，20000rpm转速下沉积病毒颗粒2h，倒去上清后以无菌pbs按1:1000的体积比对离心管底部病毒颗粒进行重悬，获得的病毒滴度可达3×10⁸tμ/ml以上。

实施例2

建立原代人甲状旁腺主细胞培养系统并进行免疫染色鉴定，结果如图1(a)-图1(d)所示；

由图1(a)-图1(d)可知，成功建立人甲状旁腺主细胞的培养系统并染色成功；

将获取的慢病毒的病毒溶液按1:200的体积比混入无血清无双抗dmem中，用于感染人甲状旁腺主细胞；12小时后，将含病毒的培养液更换为新鲜含有10％胎牛血清及1％双抗的dmem，继续培养48小时，荧光显微镜下观察，结果见图2(a)和图2(b)所示；

由图2(a)和图2(b)可知，观察到绿色荧光标记蛋白，提示光感基因标记甲状旁腺主细胞成功。

实施例3

以470nm、20hz和10mw/mm²的蓝光刺激细胞30分钟，分别在刺激后1h，2h，4h，6h和24h收集条件培养基，elisa检测pth分泌变化，实验流程见图3(a)-图3(c)，实验结果见图4(a)-图4(c)；

由图4(a)-图4(c)可知，光刺激后1小时光基因组的培养基pth浓度明显低于仅表达荧光蛋白的空壳病毒对照组，随后在6小时时恢复正常水平。

实施例4

利用构建的pth启动子的腺相关病毒对大鼠甲状旁腺组织进行感染，将光基因表达到主细胞上。通过携带光感基因的病毒载体对大鼠的甲状旁腺进行注射(0.4微升每侧)，注射21天后通过观察荧光表达情况来监测病毒表达情况；利用蓝光对分离的甲状旁腺进行刺激，并在各个时间点收集培养基检测pth浓度，实验过程见图5，结果见图6(a)和图6(b)所示，腺相关病毒的质粒图谱如图6(c)所示；

由图6(a)和图6(b)可知，elisa检测结果显示光刺激能在短时间内有效抑制pth释放，且在6小时候恢复正常。

实施例5

在动物在体水平，pth启动子aav病毒在大鼠甲状旁腺注射三周后，用蓝光在甲状旁腺位置进行刺激，光照平均强度为10mw/mm2，分别收集刺激前，刺激后5分钟，刺激后15分钟血清，elisa分析pth浓度，血钙及血磷浓度变化，实验过程见图7，结果如图8(a)-图8(c)所示；

由图8(a)-图8(c)可知，在体刺激大鼠甲状旁腺可有效抑制pth短时分泌，并对钙磷有调节作用。

综上所述，本发明提供的载体及其制备的重组腺相关病毒能够与蓝关组成调节甲状旁腺的体系，达到高时空高精度特异性调节甲状旁腺素分泌的功能，具有广阔的应用前景和市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110>中国科学院深圳先进技术研究院

<120>一种调控甲状旁腺pth分泌的载体及其应用

<130>2017

<141>2017-12-25

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>925

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

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