利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用的制作方法

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。

背景技术：

传统的制革工艺会产生大量污染，制革排放的特色四废分别是：废水、污泥、废气和固体废弃物。其中各类污染的排放以水场部分的传统灰碱法脱毛环节为甚，灰碱毁毛脱毛法脱毛效果虽好，但被溶解的毛被、表皮与灰碱等污染物占制革废水总污染物的40％。近年来研究的清洁脱毛工艺主要有酶法脱毛、灰碱法基础上的保毛脱毛、有机胺脱毛、过氧化氢氧化脱毛和其他脱毛方法。

中性蛋白酶(neutralprotease)是在中性ph条件下作用于蛋白质肽键的酶类，能将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸，可广泛用于动植物蛋白水解，皮革脱毛、软化，羊毛丝绸脱胶等。蛋白酶法脱毛制革因脱毛条件温和，对真皮中角蛋白水解少，且毛从表皮分离回收，是目前为止最有可能代替灰碱法实现清洁脱毛工业化的方法。1398、2709蛋白酶制剂在20世纪初期曾作为脱毛酶应用在制革工艺中，但因其酶系中含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，在大规模应用中如工艺控制不严会造成松面、烂皮现象；而纯化去除胶原蛋白酶所增加的工艺成本超出了制革厂的负荷，进而限制了蛋白酶制剂在皮革工业中的应用。有研究表明枯草芽孢杆菌(bacillussubtiliss14、bacillussubtilisp13)及沙福芽孢杆菌(bacillussafensislau13)等菌株发酵生产的角蛋白酶对胶原蛋白水解能力相对较差，但在脱毛工艺中仍需要严格控制酶用量及脱毛时间，否则依旧会影响成革质量。因此，亟需研制一种理想的脱毛用酶产品，实现制革行业的“节能减排”、“低碳经济”，以促进制革业转型期保持稳定发展。

为了高效表达中性蛋白酶基因，科研工作者做了很多试验。《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》(《基因组学与应用生物学》；2017年03期p906-910)中通过构建大肠杆菌原核表达载体pet30b-npre，转化大肠杆菌bl21中得到重组工程菌，初步发酵酶活为39u/ml；《枯草芽孢杆菌as1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》(《云南师范大学学报》；第25卷第3期p51-p56；2005年5月)中将编码枯草芽孢杆菌as1.398的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒ppic9k中，电转化his4缺陷型巴斯德毕赤酵母smd1168，通过md-g418平板、pcr方法筛选和鉴定重组子，最后获得发酵酶活为20000u/ml的重组菌株。然而上述方法均存在弊端，转化到大肠杆菌中容易有包涵体的形成，且需要破壁来获得酶，这些不但会降低酶活而且限制了酶的分泌表达；转化到毕赤酵母中需要甲醇来诱导产酶，然而甲醇极易蒸发、难以检测浓度、反复添加不但操作麻烦，而且容易发生污染、另外在大量甲醇存在下会形成火灾隐患，且不宜于食品等蛋白生产。

枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白质较理想的宿主。它是一种安全的表达系统，其安全程度可以达到食品级，这是一般原核表达系统无法比拟的；具有很强的蛋白质分泌功能，蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机制(分泌途径)输出到细胞外培养基中。提取不需要破碎细胞，仅需较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质；没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体；发酵条件简单，产物易于分离纯化。

分子伴侣(molecularchaperones)是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。研究表明，分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。pfeffer等在e.coli表达目的蛋白的同时表达分子伴侣蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表达比例；张海军等在原核表达体系中加入hg-pgr07分子伴侣质粒与重组质粒pet-32-pfu共表达，使hg-pgr07表达的分子伴侣蛋白能够有效促进pfu酶的可溶性表达和酶活性提高；万娟等的研究表明，pet-28a-med-orf8与分子伴侣质粒ptf16共表达后，有效减少了包涵体的形成，提高了可溶性表达量。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因。

本发明的目的之二在于提供一种利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种利用中性蛋白酶基因编码的蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837。

本发明的目的之五在于提供一种枯草芽孢杆菌bacillussubtilis在制备中性蛋白酶中的应用。

本发明的整体技术构思是：

利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因，其基因序列为seqidno.1。

利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：

a、克隆分子伴侣基因prsa

以解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)cgmccno.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行pcr反应，上游引物prsa-f：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcaatgaagaaaatcgcaatagc-3'，其中下划线为smai酶切位点；下游引物prsa-r：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为smai酶切位点；

pcr反应体系为20μl：dnamix10μl，浓度为10ng/μl的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μl的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，dmso0.8μl，灭菌水8.2μl；

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将pcr产物进行1％琼脂糖电泳；

b、pcr产物回收及纯化

采用neb公司dnagelextractionkit柱式dna胶回收试剂盒回收pcr产物，按照步骤a中的方法中进行电泳，然后切胶；

c、中性蛋白酶基因的克隆

c1、质粒酶切和新重组质粒的构建

对pht43-npr质粒进行bamhi和smai双酶切，得到pht43片段和npr片段；再以npr片段和prsa片段为模板，设计特定引物进行pcr反应，得到npr+prsa片段；最后采用gibson连接方法将pht43片段和npr+prsa片段进行连接，得到新的重组质粒；pht43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌bacillussubtiliswb800n/pht43-nprcgmccno.11625；上游引物npr-prsa-f：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为bamhi酶切位点；下游引物npr-prsa-r:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为smai酶切位点；

c2、大肠杆菌t1转化；

c3、菌液pcr初步鉴定；

c4、重组质粒dna测序及检验实验的正确性。

利用中性蛋白酶基因编码的蛋白，其序列为seqidno.2。

利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，其保藏编号为cgmccno.14837。

本发明中的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis申请人已于2017年10月26日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.14837，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为cgmcc。

枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837在制备中性蛋白酶中的应用。

本发明的具体技术构思还有：

利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因的制备方法，所述的步骤b中反应步骤及条件为：

b1、将步骤a制备的pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5ml离心管中，称量其重量，加入等重量的bindingbuffer，置于65℃水浴中至胶完全溶化；

b2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；

b3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；

b4、向吸附柱中加入700μlspwwashbuffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；

b5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；

b6、向空吸附柱中加入30μl超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；

b7、离心管中的溶液即为回收的dna片段的水溶液；

b8、取步骤b7中的水溶液3μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余dna样品于-20℃贮存；

所述的步骤c1中反应步骤及条件为：

双酶切体系：酶各1.5μl，cutsmartbuffer5μl，质粒2μg，水补齐至50μl，37℃，3h；

pcr反应体系20μl：dnamix10μl，浓度为10ng/μl的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μl的dna模版0.2μl，dmso0.8μl，灭菌水8.2μl；

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，55℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；

gibson连接体系：酶6μl，载体和片段共4μl，比例为1：3-5，金属浴50℃，1h。

所述的步骤c2中反应步骤及条件为：

将步骤c1中制备的新的重组质粒10μl与100μl的大肠杆菌t1感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入lb液体培养基800μl，37℃培养50-60min；涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板，37℃培养过夜；

所述的步骤c3中反应步骤及条件为：

用移液枪挑取转化子单克隆至lb液体培养基中培养6-8h后，进行菌液pcr；其中上游引物pht-f：5'-ttcagccgactcaaacatca-3'，下游引物pht-r：5'-ctaataagccgatattagcc-3'；

菌液pcr体系为10μl：酶5μl，上、下游引物各0.5μl，菌液0.5μl，灭菌水3.5μl；

菌液pcr条件：预变性94℃、10min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、2min，再延伸72℃、10min，30个循环，4℃保存；反应结束后将pcr产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落。

所述的步骤c4中反应步骤及条件为：

将菌落pcr鉴定为阳性克隆的转化子于盛装5mllb液体的试管中培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行dna测序；将测序后获得的序列用dnaman软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性；测序结果表明，所获得的dna片段含有中性蛋白酶基因编码区和整合的分子伴侣基因，成功构建的质粒命名为pht43-npr-prsa。

枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837在制备中性蛋白酶中的应用，包括如下工艺步骤：

按4％的比例将枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837接种于含有浓度为10μl/mlcm^r的50mllb培养基中，37℃、200rpm培养，当菌体od600≈0.5时，添加1‰iptg诱导产酶。

枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837的制备方法，包括如下工艺步骤：

a、pht43-npr-prsa质粒小量提取

采用neb公司plamidminiprepkit试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：将验证正确的含有pht43-npr-prsa质粒的大肠杆菌t1接种到5ml含有浓度为100μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养10h左右；取出菌液加到1.5ml离心管中，常温，12000rpm离心lmin，弃尽上清；加入250μl溶液ⅰ，吹打混匀；加入250μl溶液ⅱ，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min；加入350μl溶液ⅲ，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min；转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；加入700μldnawashbuffer到吸附柱中，常温12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；然后将空吸附柱于12000rpm离心2min，室温晾干15min；向空吸附柱中加入30μl超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；离心管中的溶液即为质粒dna水溶液；取3μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余dna样品于-20℃贮存。

b、枯草芽孢杆菌wb800n转化

取步骤a中的质粒dna水溶液10μl加入到400μl枯草芽孢杆菌wb800n感受态中，37℃，220rpm培养2h；涂布于含有浓度为10μg/ml氯霉素的lb固体平板，37℃过夜培养。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明将分子伴侣prsa与中性蛋白酶基因进行整合，构建了pht43-npr-prsa重组质粒，最后转化到宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n中，构建了一株新的枯草芽孢杆菌工程菌株wb800n/pht43-npr-prsa，使分子伴侣prsa与中性蛋白酶基因共表达，有效提高了中性蛋白酶的表达水平。经申请人实验证实，将本发明的枯草芽孢杆菌工程菌接种于基础发酵培养基进行初步发酵，在未对培养基及发酵条件进行充分优化的条件下，酶活比对照提高了23％-37％。

2、本发明使用枯草芽孢杆菌作为宿主菌，具有发酵条件简单、蛋白分泌能力更强、更容易获得纯度较高的目的蛋白等优点。

3、采用了gibson引物设计方法和gibson组装，确保了pcr和质粒连接的准确性。

附图说明

本发明的附图有：

图1是本发明中性蛋白酶基因及利用其编码的蛋白的序列表。

图2是克隆分子伴侣prsa片段电泳图。

图中1和2为克隆分子伴侣prsa片段的条带，由图2可知，在1000bp-750bp之间有一条特异性条带，为分子伴侣prsa片段位置。

图3是本发明中性蛋白酶酶活验证中转化子涂牛奶平板示意图。

由图3可以看出，四个菌落周围均有水解圈生成，说明有中性蛋白酶存在，从而验证了转化的成功。

图4是本发明中性蛋白酶酶活的测定中对照菌株和重组菌株发酵酶活对比示意图。

由图4可知，不同时间点的发酵酶活，重组菌株均高于对照菌株，酶活提高了23％-37％。

图5是重组菌株和对照菌株sds-page电泳图。

图5中1为对照菌株wb800n/pht43-npr；2和3为重组菌株。

由图可知，对照菌株和重组菌株在30kda-40kda之间均有一条特异性条带，并且重组菌株条带比对照菌株更亮，说明重组菌株的酶活更高。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。

实施例

1、利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因，其基因序列为：

gctgagaatcctcagcttaaagaaaacctgacgaactttgtgccgaagcattctttggtgcaatctgaattgccttcagtcagtgacaaagcaatcaagcaatacttgaaacaaaacggcaaagtcttcaaaggcaacccttctgagagactgaagctaattgaccacacgaccgatgatctcggctacaagcacttccgttatgtgcctgtcgttaacggtgtgcctgtgaaagactcgcaagtcattattcacgtcgataaatccaacaatgtctatgcgattaacggagaattaaacaacgatgcttctgccaaaacggcaaacagcaaaaaattatctgcaaatcaagcgctggatcatgcttttaaagcaatcggcaaatcacctgaagccgtctctaacggcaacgttgcaaacaaaaacaaagccgagctgaaagcagcggccacaaaagacggtaaataccgactcgcctatgatgtaaccatccgctacatcgaaccggaaccagctaactgggaagtaaccgttgatgcggaaacagggaaagtcctgaaaaagcaaaacaaagtggagcatgccgctgcaaccggaacaggtacgactcttaaaggaaaaacggtctcattaaatatttcttctgaaagcggcaaatatgtaatgcgtgatctttctaaacctaccggaacgcaaattattacgtacgatctgcaaaaccgacaatataacctgccgggcacgctcgtatcaagcactacaaaccagttcacaacttcttctcagcgcgctgccgttgatgcgcattacaatctcggcaaagtgtacgattatttctatcagacgtttaaacgcaacagctacgacaataaaggcggcaaaatcgtatcttccgttcattacggcagcaaatacaacaacgcggcctggatcggcgaccaaatgatttacggtgacggtgacggctcattcttctcgcctctttccggttcaatggacgtaacggcccatgaaatgacacacggtgttacacaggaaacagccaacttgaactatgaaaatcaaccgggtgctttaaacgaatccttctctgatgtattcggatacttcaatgatactgaggactgggatatcggtgaagatattacggtcagccagccggctctccgcagtttatccaatccgacaaaatacggacagcccgaccattacaaaaattatcgaaaccttccgaatactgatgccggcgactacggcggcgtgcatacaaacagcggaattccgaacaaagccgcttacaacacgattacaaaaatcggcgtgaaaaaagcggagcagatttactaccatgcactgacggtatatctcactccgtcatcaagctttaaagatgcaaaagcagctttgattcaatcagcgcgggacctttacggctctcaagacgctgcaagcgtagaagcggcctggaatgcagttggattgtaa。

2、利用上述中性蛋白酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列为：

gctgagaatcctcagcttaaagaaaacctgacgaactttgtgccgaagcattctttggtgcaatctgaattgccttcagtcagtgacaaagcaatcaagcaatacttgaaacaaaacggcaaagtcttcaaaggcaacccttctgagagactgaagctaattgaccacacgaccgatgatctcggctacaagcacttccgttatgtgcctgtcgttaacggtgtgcctgtgaaagactcgcaagtcattattcacgtcgataaatccaacaatgtctatgcgattaacggagaattaaacaacgatgcttctgccaaaacggcaaacagcaaaaaattatctgcaaatcaagcgctggatcatgcttttaaagcaatcggcaaatcacctgaagccgtctctaacggcaacgttgcaaacaaaaacaaagccgagctgaaagcagcggccacaaaagacggtaaataccgactcgcctatgatgtaaccatccgctacatcgaaccggaaccagctaactgggaagtaaccgttgatgcggaaacagggaaagtcctgaaaaagcaaaacaaagtggagcatgccgctgcaaccggaacaggtacgactcttaaaggaaaaacggtctcattaaatatttcttctgaaagcggcaaatatgtaatgcgtgatctttctaaacctaccggaacgcaaattattacgtacgatctgcaaaaccgacaatataacctgccgggcacgctcgtatcaagcactacaaaccagttcacaacttcttctcagcgcgctgccgttgatgcgcattacaatctcggcaaagtgtacgattatttctatcagacgtttaaacgcaacagctacgacaataaaggcggcaaaatcgtatcttccgttcattacggcagcaaatacaacaacgcggcctggatcggcgaccaaatgatttacggtgacggtgacggctcattcttctcgcctctttccggttcaatggacgtaacggcccatgaaatgacacacggtgttacacaggaaacagccaacttgaactatgaaaatcaaccgggtgctttaaacgaatccttctctgatgtattcggatacttcaatgatactgaggactgggatatcggtgaagatattacggtcagccagccggctctccgcagtttatccaatccgacaaaatacggacagcccgaccattacaaaaattatcgaaaccttccgaatactgatgccggcgactacggcggcgtgcatacaaacagcggaattccgaacaaagccgcttacaacacgattacaaaaatcggcgtgaaaaaagcggagcagatttactaccatgcactgacggtatatctcactccgtcatcaagctttaaagatgcaaaagcagctttgattcaatcagcgcgggacctttacggctctcaagacgctgcaagcgtagaagcggcctggaatgcagttggattgtaa。

3、利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：

a、克隆分子伴侣基因prsa

以解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)cgmccno.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行pcr反应，上游引物prsa-f：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcaatgaagaaaatcgcaatagc-3'，其中下划线为smai酶切位点；下游引物prsa-r：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为smai酶切位点；

pcr反应体系为20μl：dnamix10μl，浓度为10ng/μl的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μl的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，dmso0.8μl，灭菌水8.2μl；

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将pcr产物进行1％琼脂糖电泳；结果见图2。

b、pcr产物回收及纯化

采用neb公司dnagelextractionkit柱式dna胶回收试剂盒回收pcr产物，按照步骤a中的方法中进行电泳，然后切胶；

b1、将步骤a制备的pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5ml离心管中，称量其重量，加入等重量的bindingbuffer，置于65℃水浴中至胶完全溶化；

b2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；

b3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；

b4、向吸附柱中加入700μlspwwashbuffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；

b5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；

b6、向空吸附柱中加入30μl超纯水,室温静置5min，12000rpm离心3min；

b7、离心管中的溶液即为回收的dna片段的水溶液；

b8、取步骤b7中的水溶液3μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余dna样品于-20℃贮存；

c、中性蛋白酶基因的克隆

c1、质粒酶切和新重组质粒的构建

对pht43-npr质粒进行bamhi和smai双酶切，得到pht43片段和npr片段；再以npr片段和prsa片段为模板，设计特定引物进行pcr，得到npr+prsa片段；最后采用gibson连接方法将pht43片段和npr+prsa片段进行连接，得到新的重组质粒；pht43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌bacillussubtiliswb800n/pht43-nprcgmccno.11625；上游引物npr-prsa-f：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为bamhi酶切位点；下游引物npr-prsa-r:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为smai酶切位点；

双酶切体系：酶各1.5μl，cutsmartbuffer5μl，质粒2μg，水补齐至50μl，37℃，3h；

pcr反应体系20μl：dnamix10μl，浓度为10ng/μl的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μl的dna模版0.2μl，dmso0.8μl，灭菌水8.2μl；

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，55℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；

gibson连接体系：酶6μl，载体和片段共4μl，比例为1：3-5，金属浴50℃，1h；

c2、大肠杆菌t1转化；

将步骤c1中制备的新的重组质粒10μl与100μl的大肠杆菌t1感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入lb液体培养基800μl，37℃培养50-60min；涂布于含浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板，37℃培养过夜；

c3、菌液pcr初步鉴定；

用移液枪挑取转化子单克隆至lb液体培养基中培养6-8h后，进行菌液pcr；其中上游引物pht-f：5'-ttcagccgactcaaacatca-3'，下游引物pht-r：5'-ctaataagccgatattagcc-3'；

菌液pcr体系为10μl：酶5μl，上、下游引物各0.5μl，菌液0.5μl，灭菌水3.5μl；

菌液pcr条件：预变性94℃、10min，变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、2min，再延伸72℃、10min，30个循环，4℃保存；反应结束后将pcr产物进行1％琼脂糖电泳检测验证，验证正确的菌落；

c4、重组质粒dna测序及检验实验的正确性

将菌落pcr鉴定为阳性克隆的转化子于盛装5mllb液体的试管中培养12-16h，并送往擎科生物(北京)股份有限公司进行dna测序；将测序后获得的序列用dnaman软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性；测序结果表明，所获得的dna片段含有中性蛋白酶基因编码区和整合的分子伴侣基因，成功构建的质粒命名为pht43-npr-prsa。

4、枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837的制备方法，包括如下工艺步骤：

a、pht43-npr-prsa质粒小量提取

采用neb公司plamidminiprepkit试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：将验证正确的含有pht43-npr-prsa质粒的大肠杆菌t1接种到5ml含有浓度为100μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养10h左右；取出菌液加到1.5ml离心管中，常温，12000rpm离心lmin，弃尽上清；加入250μl溶液ⅰ，吹打混匀；加入250μl溶液ⅱ，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min；加入350μl溶液ⅲ，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min；转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体；加入700μldnawashbuffer到吸附柱中，常温12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；然后将空吸附柱于12000rpm离心2min，室温晾干15min；向空吸附柱中加入30μl超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min；离心管中的溶液即为质粒dna水溶液；取3μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余dna样品于-20℃贮存。

b、枯草芽孢杆菌wb800n转化

取步骤a中的质粒dna水溶液10μl加入到400μl枯草芽孢杆菌wb800n感受态中，37℃，220rpm培养2h；涂布于含有浓度为10μg/ml氯霉素的lb固体平板，37℃过夜培养。

5、枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837在制备中性蛋白酶中的应用以及中性蛋白酶酶活的验证

(1)用移液枪挑取转化子培养于含10μg/ml氯霉素lb液体培养基中，培养6-8h，吸取5-10μl菌液于牛奶平板验证中性蛋白酶活性，37℃培养1-3h，有水解圈生成的菌落即为阳性转化子。结果见图3。

(2)将对照菌株wb800n/pht43-npr与枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837按4％的比例接种于含有浓度为10μl/mlcm^r的50mllb培养基中，37℃、200r/min培养。当菌体od600≈0.5时，添加1‰iptg诱导产酶，诱导24、36、48h后取样，采用folin-酚法(gb/t23527-2009)测定中性蛋白酶酶活。结果见图4。

6、枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscgmccno.14837及对照菌株表达中性蛋白酶跑蛋白胶验证。结果见图5。

序列表

<110>河北省微生物研究所

中国科学院微生物研究所

<120>利用分子伴侣prsa构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用

<130>《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》（《基因组学与应用生物学》；2017年03期p906-910）；《枯草芽孢杆菌as1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》（《云南师范大学学报》；第25卷第3期p51-p56；2005年5月）

<160>2

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