一种器官体外培养系统的制作方法

本发明属于器官体外培养技术领域，具体涉及一种器官体外培养系统。

背景技术：

每天全球成千上万器官衰竭病人等待着器官移植，以延长生命，然而，器官的短缺是当今世界面临的一大难题。器官再生已经成为研究的热点。器官再生是指通过器官移植和人工器官或者手术使功能障碍的器官发挥功能。由于用于移植的器官严重短缺，人造器官成为器官再生研究的重点，器官的体外培养成为研究的重中之重。在18世纪人们就开始了对器官培养的研究，《Organ culture》一书于1964年在巴黎以法语的形式出版，1970年J.Thomas重新修订后以英文的形式重新出版，该书不断的被修订，增加最新的器官研究新进展，对器官研究起了极大的推动作用。该书还介绍了一些器官培养的主要方法：1)凝固的血浆基质培养法。最初是由Fell，H.B和Robison创立的，将器官碎片或者器官放置在覆盖有凝固的血浆和鸡胚浸出液的表面皿上培养¹。2)琼脂基质培养法。1952年E.Wolff等人在含有胚抽出液的琼脂培养基上直接放置器官的方法进行器官培养。3)漂浮法4)格栅培养法5)交替暴露于培养液和气相培养法。人们不断探索体外器官培养的方法和影响器官培养的因素，并取得显著成就。早在19世纪60年代人们探索了人小肠体外培养的方法，并获得了一些经验。首先器官的培养通常用与体内细胞生长相似的3D培养方法并且器官的体外培养还受到激素的调节；其次，气体的组分也是影响器官培养的重要因素。细胞在培养过程中，一般需要5％的CO₂浓度和95％的空气，而器官对O₂的需求量则大大增加，在心脏³和小肠²培养过程中O₂的浓度达到90％以上。3D培养方法在人造器官中应用广泛，人造骨骼即是采用生骨细胞接种3D支架进行骨骼的培养。细胞在体内的3D生长环境和细胞在体外的2D培养相比，细胞在迁移、粘附、增殖和基因表达方面存在着很大的差异。已发现间充质干细胞在3D培养和2D培养中蛋白的表达存在差异，3D培养能更精确地模拟正常细胞的形态、增殖和分化，所以3D培养更广泛的应用于组织工程器官的构建。近来，含磁性氧化铁的水凝胶已被广泛应用于细胞的3D培养，细胞可以在悬浮在培养基和磁性物质当中，摆脱细胞因重力的作用而发生的聚集。3D细胞培养技术应用于组织工程的构建具有以下优势：1)3D细胞培养体系使细胞生长微环境的建立更加简单；2)3D细胞培养体系更接近于体内细胞生长环境，细胞的生长分化更接近于体内，从而使得工程组织器官的功能更接近正常器官；3)天然的三维支架材料在3D培养中具有独特的优势，首先3D天然支架免疫原性低于非天然的合成支架，其次，3D天然支架通透性好，减少了氧气不足的发生，给细胞的生存分化提供了基本的附着基质。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种器官体外培养系统。

本发明的技术方案如下：

一种器官体外培养系统，包括：

一混合气体罐，用以供应器官培养所需要的氧气和二氧化碳的混合气体；

一培养基容器，其内盛装有培养基，并具有伸入培养基液面以下的一进气管、一出液管和一入液管，；

一一次性输液管加热装置；

一器官培养套瓶，包括一外腔和一内腔，外腔包裹内腔以使内腔内保持恒定的37℃且与内腔隔绝，内腔内具有二器官培养固定管，用以将脱细胞支架固定在内腔中；

和一滴定泵；

混合气体罐连通培养基容器的进气管，培养基容器的出液管通过输液管和一次性输液管加热装置与滴定泵的进液端连通，一次性输液管加热装置用以加热流经上述输液管内的培养基，滴定泵的出液端连通器官培养套瓶的一器官培养固定管，器官培养套瓶的另一器官培养固定管与培养基容器的入液管连通。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括一恒温浴槽，该恒温浴槽连通器官培养套瓶的外腔，使得该外腔中充满恒定的37℃的加热液体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述滴定泵为卡默尔多功能智能调速计量泵KSP-F01A。

本发明的有益效果：

1、本发明利用泵的工作原理，将泵引入培养系统，可以解决器官培养中培养基更换问题，使得培养的器官可以得到足够的养分，利于其生长。

2、器官培养与细胞培养不同，其需要更多的气体供应。本发明利用具有伸入培养基液面以下的一进气管、一出液管和一入液管的培养基容器解决了气体供应问题，使器官能够在充足的气体环境中发育。

3、本发明解决了采用培养基循环系统，使培养基在器官中循环流动，并可控制流动速度及流动时间，使器官得到足够的养分。

4、对于解决37℃培养的器官的温度条件，本发明采用37℃水浴泵循环流动，以保持培养瓶中温度始终维持在37℃，使得细胞在此温度下能够在器官中增殖发育。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为处理中的心脏脱细胞支架，A为心脏脱细胞支架在PBS灌流液中的状态照片；B为心脏脱细胞支架在DMEM培养基平衡中的状态照片。

图3为心脏脱细胞支架接种细胞的状态照片。

图4为心脏脱细胞支架的HE染色照片，其中A为接种细胞前的状态；B为接种细胞后培养一周的状态。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明进行进一步的说明和描述。

如图1所示，一种器官体外培养系统，包括一混合气体罐1、一培养基容器2、一一次性输液管加热装置3、一器官培养套瓶4、一恒温浴槽5和一滴定泵6。

混合气体罐1，用以供应器官培养所需要的氧气和二氧化碳的混合气体，其可以通过阀门调节混合气体的进气量，保证培养基中氧气的含量，从而通过培养基的供给保证器官在培养过程中供给氧气充足；

培养基容器2，其内盛装有培养基，并具有伸入培养基液面以下的一进气管21、一出液管22和一入液管23，可以使含有饱和气体的培养基循环利用；

一次性输液管加热装置3，可选为输液恒温器或输液加温棒，可以恒温加热从培养基容器2中泵出的培养基，从而使进入器官的培养基保持37℃的最佳温度；

器官培养套瓶4，包括一外腔41和一内腔42，外腔41包裹内腔42以使内腔42内保持恒定的37℃且与内腔42隔绝，内腔42内具有二器官培养固定管43，用以将脱细胞支架固定在内腔42中；

恒温浴槽5，连通器官培养套瓶4的外腔41，使得该外腔41中充满恒定的37℃的加热液体，为器官培养套瓶4中的器官提供最适环境温度；

滴定泵6，优选为卡默尔多功能智能调速计量泵KSP-F01A，可以持续定时定量的从培养基容器2中吸取培养基进入器官培养套瓶4中，从而保证器官在营养充足的新鲜培养基中进行培养；

混合气体罐1连通培养基容器2的进气管21，培养基容器2的出液管22通过输液管和一次性输液管加热装置3与滴定泵6的进液端连通，一次性输液管加热装置3用以加热流经上述输液管内的培养基，滴定泵6的出液端连通器官培养套瓶4的一器官培养固定管43，器官培养套瓶4的另一器官培养固定管43与培养基容器2的入液管23连通。

用本发明培养大鼠心脏的过程如下：

1)大鼠心脏摘取后，置于器官培养套瓶4的内腔42中，心脏的肺动脉与器官培养套瓶4的一器官培养固定管43连接并结扎结实，该器官培养固定管43为消化液或者培养基的流出口，主动脉弓与另一器官培养固定管43连接并结扎结实，该器官培养固定管43为消化液或者培养基的流入口。

2)将1％的SDS溶液置于培养基容器2中，打开滴定泵6，灌流500ml的1％的SDS，随后灌流500ml的双蒸水，接着灌流0.5％的Triton X-100溶液100ml，形成心脏脱细胞支架，再用1L的无菌PBS灌流，清洗平衡心脏脱细胞支架(如图2A所示)。

3)用1L的DMEM平衡心脏脱细胞支架(如图2B所示)。

4)打开混合气体罐1，用95％的氧气和5％的二氧化碳气体通过软管通入培养基容器2中的培养基中，使培养基氧气饱和，再打开一次性输液管加热装置3和恒温浴槽5，使得培养基和心脏脱细胞支架温度保持在37℃，在此环境下灌流200ml DMEM/FBS平衡心脏脱细胞支架，为细胞接种做准备。

5)调节滴定泵6，使泵的速度为1分钟注入500ul的DMEM心肌细胞完全培养基。

6)准备细胞1×10⁷个细胞，将细胞从连接主动脉弓的器官培养固定管43注射入心脏，继续培养一周，即可看到细胞在心脏脱细胞支架上定植生长(如图2至图4所示，图2A和B中的心脏脱细胞支架中无细胞存在，经过器官培养系统培养后，如图3所示，眼观可以看到心脏基质变得不透明，有细胞存在于心脏脱细胞支架中，如图4A所示，接种细胞前心脏脱细胞支架中无细胞存在，经器官培养系统培养后，如图4B所示，有细胞在基质中定植存在于心脏脱细胞支架)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。