细胞培养器的制造方法

细胞培养器的制造方法
【技术领域】 本发明涉及细胞培养器、该细胞培养器的制造方法及使用了该细胞培养器的细胞凝集 块（也称为细胞球（sphere))的制造方法。本发明尤其涉及特征在于在表面上涂覆有具有 抑制生物材料尤其是细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器及其制造方法。
【背景技术】 近年来，用于使在动物、植物体内发挥不同作用的各种器官、组织及细胞在机体外增殖 或维持的技术不断发展。使上述器官、组织在机体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织 培养，使从器官、组织分离的细胞在机体外增殖、分化或维持被称为细胞培养。细胞培养是 在培养基中使分离的细胞在机体外增殖、分化或维持的技术，对于详细分析机体内的各种 器官、组织、细胞的功能及结构是不可缺少的。另外，利用该技术培养的细胞和/或组织已 在化学物质、医药品等的药效及毒性评价、酶、细胞增殖因子、抗体等有用物质的大量生产、 修复因疾病、缺损而丧失的器官、组织、细胞的再生医疗、植物的品种改良、基因重组作物的 制成等多种领域中被利用。 来源于动物的细胞根据其形状主要可分为悬浮细胞和贴壁细胞。悬浮细胞是生长?增 殖不需要固定位置的细胞，贴壁细胞是生长?增殖需要固定位置的细胞，构成机体的大部分 细胞是后者的贴壁细胞。作为贴壁细胞的培养方法，已知单层培养、分散培养、包埋培养、微 载体培养、及细胞凝集块（细胞球）培养等。 尤其是，近年来，伴随着再生医疗领域的发展，作为在更接近机体内的环境中培养的方 法，细胞球培养受到关注，报道了多种适于该培养的培养基组合物、培养基添加剂（例如， 参见专利文献1及2)。另外，认为细胞球培养中，来自培养容器（基材）的刺激是影响培养 结果的重要因素，人们需要在不存在来自培养容器的刺激的三维环境或完全的悬浮状态下 培养细胞（尤其是细胞凝集块）（例如，参见专利文献3)。 现有技术文献 专利文献
[专利文献1]国际公开第2014/017513号公报 [专利文献2]国际公开第2013/144372号公报 [专利文献3]日本特开2008 - 61609号公报
【发明内容】
发明所要解决的课题 本发明的目的在于提供细胞培养器、该细胞培养器的制造方法及使用了该细胞培养器 的细胞凝集块的制造方法。尤其是，本发明的目的在于提供特征在于在表面涂覆有具有抑 制生物材料尤其是细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器、该细胞培养容器的制造方法 及使用了该细胞培养容器的细胞凝集块的制造方法。 以往，为了在三维环境中或完全的悬浮状态下培养细胞（尤其是细胞凝集块），存在细 胞附着于容器表面（壁面）、以及细胞培养容器所带有的涂层溶出到培养液这样的问题。虽 然带有基于亲水性化合物的涂层的细胞培养容器能改善细胞在容器表面（壁面）上的附 着，但依然存在细胞培养容器所带有的涂层向培养液的溶出等问题。另外，还存在以下这样 的问题：基于亲水性化合物的涂层相对于放射线的耐性不充分，在涂覆后不能利用放射线 灭菌的情况很多，需要进行无菌生产。 用于解决课题的手段 本申请的发明人着眼于作为具有抑制多种生物材料附着的能力的涂覆材料而受到期 待的具有磷酸酯基的聚合物，进行了深入研究。结果发现，用包含特定的有机基团的共聚物 涂覆表面的至少一部分而得到的细胞培养容器，不仅抑制细胞在容器表面（壁面）上附着， 而且，涂层可在容器表面上牢固地固着，因此，作为涂层的向培养液的溶出、放射线耐性得 到改善的细胞培养容器是有用的，从而完成了本发明。 即，本发明如下所述： 1. 细胞培养容器，其特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共聚物包含：包含下 述式（a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式（b)表示的有机基团的重复单元；
(式中，1]'俨、1]'#及1^3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链或支链 烷基，而且ArT表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的 阴离子。） 2. 上述项1所述的细胞培养容器，其中，包含上述式（a)表示的有机基团的重复单元及 包含上述式（b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式（A)及（B)表示的单体衍生的 重复单元；
(式中，Γ、Tb、Ual、Ua2、Ubl、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链 或支链烷基，93及。各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，各自独立地表示可被卤 原子取代的、碳原子数1~10的直链或支链亚烷基，ArT表示选自卤化物离子、无机酸根离 子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m表示0~6的整数。） 3. 上述项2所述的细胞培养容器，其中，m为1，Ra及Rb各自独立地表示亚乙基或亚丙 基； 4. 上述项1~3中任一项所述的细胞培养容器，其中，上述共聚物还包含由下述式（C) 或（D)表示的单体衍生的交联结构；
(式中，1^、1^及1^各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链或支链烷基，ΙΓ及Rd各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1~10的直链或支链亚烷基。） 5. 上述项4所述的细胞培养容器，其中，rSTd各自独立地表示氢原子或甲基，1^表 示氢原子，1^及Rd各自独立地表示亚乙基或亚丙基； 6. 细胞培养容器的制造方法，包括以下工序： 将下述共聚物涂覆于容器表面的至少一部分上的工序，所述共聚物包含：包含下述式 (a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式（b)表示的有机基团的重复单元；以及 于一 200 °C~200 °C干燥经涂覆的容器的工序；
(式中，1]'俨、1]'#及1^3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链或支链 烷基，而且ArT表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的 阴离子。） 7. 上述项6所述的制造方法，其中，包含上述式（a)表示的有机基团的重复单元及包含 上述式（b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式（A)及（B)表示的单体衍生的重复 单元；
(式中，Γ、Tb、Ual、Ua2、Ubl、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链 或支链烷基，93及。各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，各自独立地表示可被卤 原子取代的、碳原子数1~10的直链或支链亚烷基，ArT表示选自卤化物离子、无机酸根离 子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m表示0~6的整数。） 8. 上述项6或7所述的制造方法，其中，使用包含共聚物的清漆实施涂覆工序； 9. 上述项8所述的制造方法，其中，包含共聚物的清漆预先经pH调节； 10. 上述项6~9中任一项所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工 序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序； 11. 上述项10所述的制造方法，其中，干燥工序后的洗涤使用选自水和含有电解质的 水溶液中的至少1种溶剂来实施； 12. 上述项6~11中任一项所述的制造方法，其中，还包括在干燥后利用放射线处理进 行灭菌的工序； 13. 细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用利用上述项1~5中任一项所述的细胞 培养容器或上述项6~12中任一项所述的制造方法制造的细胞培养容器； 14. 上述项13所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，细胞培养容器中的培养基 包含多糖类，所述多糖类形成纳米纤维，具有使细胞或组织悬浮的效果； 15. 上述项14所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，多糖类为脱酰基化结冷胶。 发明的效果 本发明的细胞培养容器通过使用用包含特定的有机基团的共聚物涂覆表面的至少一 部分而成的容器，可抑制细胞附着到容器表面（壁面）上。本发明的细胞培养容器是用包含 式（a)表示的阴离子、式（b)表示的阳离子的共聚物涂覆容器表面的至少一部分而得到的， 因此可认为，通过该阳离子及阴离子的静电平衡，容器元件的表面保持电中性，可防止细胞 的附着。另一方面，通过涂层中的该阳离子及阴离子形成离子键（离子络合），从而成为能 对容器基材种类没有选择性地固着于玻璃、纤维、无机粒子或树脂（合成树脂及天然树脂） 等，并且，固着后相对于水系溶剂（水、磷酸缓冲液（PBS)、醇等）的耐久性优异的涂层。另 外，上述涂层的放射线耐性也优异，可利用放射线进行灭菌。即，通过本发明，可提供除了抑 制细胞的附着之外、相对于溶剂、放射线的耐久性也优异的细胞培养容器。
【附图说明】
[图1]表示试验例1中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板培养的!fepG2 细胞的凝集块的显微镜照片（倍率：40倍）。
[图2] (a)表示试验例3中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板、使用未 添加脱酰基化结冷胶的培养基培养的IfepG2细胞的凝集块的显微镜照片（倍率：40倍）。 (b)表示试验例3中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板、使用添加有脱酰基 化结冷胶的培养基培养的IfepG2细胞的凝集块的显微镜照片（倍率：40倍）。 【具体实施方式】 《细胞培养容器》 本发明的第一方式为细胞培养容器，其特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共 聚物包含：包含下述式（a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式（b)表示的有机基团 的重复单元。
(式中，1]'俨、1]'#及1^3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1~5的直链或支链 烷基，而且ArT表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的 阴离子。） <细胞> 本发明中的细胞是指构成动物或植物的最基本的单位，作为其要素，在细胞膜的内部 具有细胞质和各种细胞器。此时，细胞内部可包含内含DNA的核，也可不包含内含DNA的 核。例如，本发明中的来源于动物的细胞包括精子、卵子等生殖细胞，构成机体的体细胞，干 细胞（多能干细胞等），前体细胞，从机体分离出的癌细胞，从机体分离、且获得不死能力、 并可在体外稳定维持的细胞（细胞株），从机体分离、且人为改变基因而得到的细胞，从机 体分离、且人为更换了核的细胞等。作为构成机体的体细胞的例子，包括但不限于成纤维 细胞、骨髓细胞、Β淋巴细胞、Τ淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细 胞、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突状细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、 表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、神经胶质 细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞 (例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞）、胰岛β细胞细胞、黑素细胞、定向造血干细胞（例如， 来源于脐带血的CD34阳性细胞）、及单核细胞等。该体细胞例如包括从皮肤、肾脏、脾脏、 肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结 缔组织、骨、软骨、血管组织、血液（包括脐带血）、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等任意的组 织采集的细胞。干细胞是指兼有复制自身的能力和分化成其他多种系统的细胞的能力的细 胞，作为其例子，包括但不限于胚胎干细胞（ES细胞）、胚胎肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、诱 导多能干细胞（iPS细胞）、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、 肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出上述 干细胞中的ES细胞、胚性生殖干细胞、iPS细胞。前体细胞是指处于从上述干细胞分化成 特定的体细胞、生殖细胞中途的阶段的细胞。癌细胞是指从体细胞派生的获得无限增殖能 力的细胞。