培养容器和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞的培养以及细胞的回收的技术。
【背景技术】
[0002] 随着近年来细胞工程学的发展，开发出模仿生物体内的细胞周围环境、形态而获 得具有更接近生物体内的机能的细胞的新的培养方法。利用这样的方法培养出的细胞开始 尝试着作为治疗、生物体反应的模拟器来使用。开发出如下各种方法：使用由海绵、纤维等 构成的培养载体进行培养的方法、在培养基中使细胞悬浮而自然地形成球状体的悬浮培养 以及在以往的培养容器（烧瓶等）中实施细胞非粘附处理而形成球状体的方法等。特别 是球状体培养是能够维持细胞的相互作用的优秀方法，能够应用于胰岛细胞、肝细胞、干细 胞、癌细胞等各种各样的细胞。近年来，进行了关注球状体的大小的研究，例如在使用了癌 细胞的药品筛选试验中，将球状体的直径、体积作为指标（非专利文献1)。另外，显示出了 根据球状体的大小而细胞所具有的机能不同的情况（非专利文献2、3)。除了像这样用于形 成球状体的技术以外，控制球状体的大小的技术开始受到关注。而且，因为能够如此再现细 胞的特殊机能，所以期待在人工脏器、生物反应器等领域加以使用。在这样的用途中，大量 地制作球状体并进行回收的技术变得重要。
[0003] 作为制作直径均等的球状体的方法，在专利文献1中，存在通过改变在具有设置 有亲水性膜的U字底部的96WP中所接种的细胞数的个数来控制所形成的球状体的大小的 方法。但是，单位培养面积的球状体数的数量较少，难以制作大量的球状体。作为其他方法， 在专利文献2-4中公开一种在微型空间内形成球状体的方法。
[0004] 专利文献1 :日本特开平8-131153号公报
[0005] 专利文献2 :日本特开2010-88347号公报
[0006] 专利文献3 :国际公开第2012/036011号
[0007] 专利文献4 :国际公开第2013/042360号
[0008] 非专利文献 1:JuergenFriedrichl、他著、〃Spheroid-baseddrugscreen: considerationsandpracticalapproach"、PR0T0C0L、2009 年 2 月 12 日（Published online)pp. 309-324
[0009] 非专利文献 2:FranziskaHirschhaeuser，他著、〃Multicellulartumor spheroids：Anunderestimatedtooliscatchingupagain〃、Journalof Biotechnology148、2010 年、pp. 3-15
[0010] 非专利文献 3 :C'ELINELIUBAUWENS、他著、〃ControlofHumanEmbryonic StemCellColonyandAggregateSizeHeterogeneityInfluencesDifferentiation Trajectories"、STEMCELL、2008 年、pp. 2300-2310
【发明内容】
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 然而，专利文献1的培养方法的培养效率极低，成为进行大量培养时的瓶颈。另 外，专利文献2、3的培养方法虽然单位面积的球状体形成效率较高，但是在培养基更换时 球状体有可能自空间内脱离。因此，需要在培养基更换时加以注意。而且，为了防止球状体 的脱离，对使球状体的一部分粘附在微型空间内的方法进行研讨（专利文献4)。但是，细胞 的粘附性因各种细胞而异，因此需要针对所使用的每个细胞研讨表面处理方法，影响实用 性。
[0013] 本发明鉴于这样的情况而做成，其目的在于提供一种培养容器和使用该培养容器 的培养方法，该培养容器能够高效或者高效且大量地制造出大小均匀的球状体，通过设计 能够容易实施培养基更换和细胞回收的微型空间构造而具有所设计的微型空间构造。
[0014] 用于解决问题的方案
[0015] 本发明的一实施方式的培养容器的一技术方案为：该培养容器排列有具有底部和 开口部的多个凹陷。所述底部具有半球状和圆锥台状中的任一种形状，所述开口部由从与 所述底部的交界开始包围到所述凹陷的端部的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成。除 此以外，所述交界的等效直径为50μm以上且2. 5mm以下，从所述底部的底到所述端部的深 度为所述等效直径的〇. 6倍以上且3倍以下，构成所述开口部的壁形成有与所述底部相连 续的面，且所述相连续的面的倾斜在所述交界处发生变化。
[0016] 另外，在一实施方式的培养容器中，优选的是，所述端部的形状为半球状、梯形和 倒三角形中的任一种形状，相邻的两个凹陷之间是平坦的，优选的是，所述两个凹陷的距离 为 5μm~50μm〇
[0017] 而且，一实施方式的培养用的所述培养容器优选是由丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙 醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇 类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂以及有机硅树脂中的一种 或者它们的组合构成的树脂成形品。利用向所述凹陷实施的由等离子体处理、玻璃涂覆、电 晕放电、UV臭氧处理中的任一种方法或者这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成官 能团，优选的是，以水接触角为45度以下的方式进行处理。
[0018] 优选的是，向所述凹陷固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物链。
[0019] 优选的是，向所述凹陷固定有磷脂或者磷脂?高分子复合物。
[0020] 优选的是，针对所述凹陷，利用等离子体处理、玻璃涂覆、电晕放电、UV臭氧处理中 的任一种方法或者由这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成官能团，并以水接触角 为45度以下的方式进行处理后，获得固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物链以及 磷脂或者磷脂?高分子复合物中的任一种聚合物的细胞非粘附表面。
[0021] 所述亲水性的聚合物链优选为聚甲基丙烯酸羟乙酯，更加优选所述聚甲基丙烯酸 羟乙酯的平均分子量为10万以上。
[0022] 本发明的一实施方式的培养方法的一技术方案为使用上述任一种培养容器。而 且，在该培养方法中，使总细胞数为所述培养容器所具有的所述凹陷的数量（N)以上、且为 将所述凹陷所形成的空间的体积（VI)除以所接种的细胞的体积（V2)得到的数值乘以所述 凹陷的数量（N)而得出的数量以下的细胞分散到培养基，并将所述培养基添加到所述培养 容器。
[0023] 本发明的一实施方式的培养方法的一技术方案为优选使所述凹陷所形成的每个 空间形成有一个球状体，更优选在所述空间形成球状体且使球状体成长（增殖）。
[0024] 在对球状体进行分化诱导的情况下，优选的是，在使球状体形成于所述空间的状 态下进行诱导。
[0025] 优选的是，形成于所述培养容器内的球状体的总数的60%以上的直径是在平均球 状体直径的正负5%的范围内的直径。
[0026] 优选的是，通过搅拌所述培养基来回收所述凹陷内的细胞，所述培养基的搅拌的 方法为如下方法中的任一种方法：通过振荡所述培养容器来搅拌所述培养基的方法、通过 吸引和排出所述培养基来搅拌所述培养基的方法、通过在所述培养容器中设置搅拌叶片来 搅拌培养基的方法、通过将搅拌棒放入所述培养容器来搅拌培养基的方法、或者将这些方 法组合而成的方法。
[0027] 优选的是，至少对所述培养基进行1次以上更换，并且所更换的培养基的比例为 20%以上。
[0028] 本发明的一实施方式的培养方法的另一技术方案为使用上述任一种培养容器。而 且，培养方法通过实施以下的各工序来进行细胞的接种、细胞的培养、培养基的更换以及细 胞的回收。
[0029] a)使存在于所述培养容器的凹陷的数量（N)以上且在将所述凹陷的体积（VI)除 以所接种的细胞的体积（V2)得到的数值乘以所述凹陷的数量（N)而得出的数量以下的细 胞数分散到培养基，并将所述培养基添加到所述培养容器的工序；
[0030] b)在所述培养容器内培养所述细胞12小时以上并使所述细胞形成为球状体的工 序；
[0031] c)吸引20%以上的所述培养基之后注入同量的新鲜培养基的工序；
[0032] d)重复数次所述a)至c)的工序以使球状体成长的工序；
[0033] e)在使所述球状体成长到所希望的大小之后搅拌所述培养基以使各凹陷内的细 胞悬浮在所述培养基中的工序；以及
[0034] f)利用吸引机针对每个所述培养基吸取所述细胞来回收所述细胞的工序。
[0035] 发明的效果
[0036] 采用本发明，能够提供一种培养容器和使用该培养容器的培养方法，该培养容器 在能够高效且大量地制造出大小均匀的球状体的基础上、通过设计能够容易实施培养基更 换和细胞回收的微型空间构造而具有所设计的微型空间构造。
【附图说明】
[0037] 图1是表不一实施方式的培养容器的一例的图。
[0038] 图2是表示从横向观察实施方式1的凹陷而得到的形状例的剖视图。
[0039] 图3是表示从上方观察实施方式1的凹陷而得到的形状例的图。
[0040] 图4是表示实施方式2的使用球形状的一部分的凹陷的形状例的图。
[0041] 图5是表示实施方式2的使用球形状的一部分的凹陷的其他形状例的图。
[0042] 图6是表示实施方式2的使用圆锥台的凹陷的形状例的图。
[0043] 图7是表示实施方式2的凹陷的其他形状例的图。
[0044] 图8是表示实施方式3的开口部的形状例的图。
[0045] 图9是表示实施方式3的开口部的其他形状例的图。
[0046] 图10是表示实施方式4的培养容器的结构例的图。
[0047] 图11是表不实施方式4的另一培养容器的结构例的图。
[0048] 图12是表不实施方式4的又一培养容器的结构例的图。
[0049] 图13是表示实施例和比较例的培养基更换时的球状体的残存率的图。
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