凹陷的数量。
[0138] (2)培养方法
[0139] 为了通过图像解析计算出后述的残存率和回收率，使用了由GFP进行荧光标识过 的内胚叶细胞。将该内胚叶细胞、血管内皮细胞、人骨髓间充质干细胞分别以10 :5-10 :2的 比例混合，并在内皮细胞培养基试剂盒-2 :EGM-2BulletKit(产品编号CC-3162 :Lonza)中 进行了 30天的培养。培养基每两天更换一次。
[0140] (3)球状体残存率的测定
[0141] 使用共焦点激光显微镜，观察孔整体、使用图像解析软件识别球状体，并对该数量 进行计数来作为球状体数量。利用以下公式计算出球状体残存率。
[0142] 球状体残存率（％)=球状体数X100/微型空间的数量
[0143] 细胞接种后的数小时后（0天），在任一个培养容器的90%以上的微型空间中也形 成有球状体这样的块。将培养第10天、第20天的培养基更换后的球状体的数量分别除以 第0天的球状体数量而得到的数值作为球状体残存率。
[0144] (4)回收方法
[0145] 培养完成后，使用移液管（厂家、型号）搅拌溶液并将悬浮起来的球状体回收。例 如，因为在24孔板中放入500μL~lmL的培养基，因此使用能够吸引最大lmL的培养基的 移液管是合适的。
[0146] (5)回收效率
[0147] 在回收前后，利用共焦点激光显微镜取得图像。
[0148] (6)结果
[0149] 在图13中示出培养基更换时的球状体的残存率。纵轴表示球状体的残存率 (SphereNumber)，横轴表示培养天数。
[0150] 在图13中，示出了从培养开始到第20天为止的数据。如图13所示，与实施例相 比，比较例大幅减少。在培养了 20天之后，实施例的球状体的残存率为60%以上，提高到比 较例的1. 5倍。
[0151] 在图14中，示出了实施例和比较例的培养基更换前后的球状体的图像。在图14 中，示出了培养第四天、第二次更换培养基前后的培养容器内的球状体的图像。图14的左 侧是实施例（Kurarayp-HEMA)的照片，右侧是比较例（IwakiMPC)的照片。另外，上部表 示培养基更换前的照片，下部（比箭头靠下）表示培养基更换后的照片。更详细而言，下部 的照片是表示从培养基更换前的状态到实施了将培养基的一半量更换（半量更换）的两次 培养基更换后的情况。
[0152] 在照片中所看到的白色部分是球状体。在培养基更换前整体确认球状体。培养基 更换后，在实施例中培养基更换前后没有较大差异，大部分的球状体都残存下来，在比较例 中只有大约一半程度的球状体残存下来。
[0153] 在图15中示出实施例的回收了细胞前后的图像。在图15中，左侧（BEFORE)是回 收前的图像，右侧（AFTER)是回收后的图像。上部表示培养容器整体的图像，下部表示将培 养容器的一部分放大后的图像。在图16中不出实施例的从培养容器回收之后的球状体的 照片。
[0154] 微型容器（凹陷）内的黑色圆形的点状物是球状体。在回收后的图像中，点状物 消失，所以能够几乎100%回收。另外，如图16所示，回收后的细胞的形态形成为良好的球 状体的形式，回收操作未破坏球状体。
[0155] 而且，本发明并不限于上述所示的实施方式。在本发明的范围内，上述实施方式的 各要素能够在本领域技术人员容易考虑到的情况中进行变更、追加以及变换。
[0156] 本申请主张以2013年6月7日提出申请的日本申请特愿2013-120915为基础的 优先权，将其公开的全部内容引入本说明书中。
[0157] 附图标iP,说明
[0158] 1培养容器
[0159] 3、5培养板
[0160] 4A、5A培养面
[0161 ] 5培养烧瓶
[0162] 10、20A~20D、30A、30B、40、50凹陷
[0163] 11、21A~21D底部
[0164] 12、32A、32B开口部
【主权项】
1. 一种培养容器，其中， 该培养容器排列有具有底部和开口部的多个凹陷， 所述底部具有半球状和圆锥台状中的任一种形状， 所述开口部由从与所述底部之间的交界开始包围到所述凹陷的端部的、锥角为1度以 上且20度以下的壁构成， 所述交界的等效直径为50μm以上且2. 5mm以下，从所述底部的底到所述端部的深度 为所述等效直径的〇. 6倍以上且3倍以下， 构成所述开口部的壁形成有与所述底部相连续的面，且所述相连续的面的倾斜在所述 交界处发生变化。2. 根据权利要求1所述的培养容器，其特征在于， 所述端部的形状为半球状、梯形和倒三角形中的任一种形状。3. 根据权利要求1或2所述的培养容器，其特征在于， 相邻的两个凹陷之间是平坦的，所述两个凹陷的距离为5μπι~50μπι。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的培养容器，其特征在于， 所述培养容器是由丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯 类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热 塑性弹性体、氯乙烯类树脂以及有机硅树脂中的一种或者它们的组合构成的树脂成形品。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的培养容器，其特征在于， 针对所述凹陷，利用等离子体处理、玻璃涂覆、电晕放电、UV臭氧处理中的任一种方法 或者由这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成官能团，且以水接触角为45度以下 的方式进行处理。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的培养容器，其特征在于， 向所述凹陷固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物链。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的培养容器，其特征在于， 向所述凹陷固定有磷脂或者磷脂?高分子复合物。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的培养容器，其特征在于， 针对所述凹陷，利用等离子体处理、玻璃涂覆、电晕放电、UV臭氧处理中的任一种方法 或者由这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成官能团，并以水接触角为45度以下 的方式进行处理后，获得固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物链以及磷脂或者磷 脂?高分子复合物中的任一种聚合物的细胞非粘附表面。9. 根据权利要求8所述的培养容器，其特征在于， 所述亲水性的聚合物链为聚甲基丙烯酸羟乙酯。10. 根据权利要求9所述的培养容器，其特征在于， 所述聚甲基丙烯酸羟乙酯的平均分子量为10万以上。11. 一种培养方法，其特征在于， 使用所述权利要求1至10中任一项所述的培养容器， 使总细胞数为所述培养容器所具有的所述凹陷的数量Ν以上且为将所述凹陷所形成 的空间的体积VI除以所接种的细胞的体积V2得到的数值乘以所述凹陷的数量Ν而得出的 数量以下的细胞分散到培养基， 将所述培养基添加到所述培养容器。12. 根据权利要求11所述的培养方法，其特征在于， 在所述凹陷所形成的每个空间内形成有一个球状体。13. 根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于， 在所述空间形成球状体且使球状体成长。14. 根据权利要求12或13所述的培养方法，其特征在于， 在所述空间形成球状体并进行分化诱导。15. 根据权利要求11至14中任一项所述的培养方法，其特征在于， 形成于所述培养容器内的球状体的总数的60%以上的直径是在平均球状体直径的正 负5%的范围内的直径。16. 根据权利要求11至15中任一项所述的培养方法，其特征在于， 通过搅拌所述培养基来回收所述凹陷内的细胞。17. 根据权利要求16所述的培养方法，其特征在于， 所述培养基的搅拌是如下方法中的任一种方法：通过振荡所述培养容器来搅拌所述培 养基的方法、通过吸引和排出所述培养基来搅拌所述培养基的方法、通过在所述培养容器 中设置搅拌叶片来搅拌培养基的方法、通过将搅拌棒放入所述培养容器来搅拌培养基的方 法或者将这些方法组合而成的方法。18. 根据权利要求11至17中任一项所述的培养方法，其特征在于， 至少对所述培养基进行1次以上更换，并且所更换的培养基的比例为20%以上。19. 一种培养方法，其特征在于， 使用所述权利要求1至10中任一项所述的培养容器，通过实施以下工序来进行细胞的 接种、细胞的培养、培养基的更换以及细胞的回收， a) 使存在于培养容器的凹陷的数量η以上且在将所述凹陷的体积V除以所接种的细胞 的体积ν得到的数值乘以所述凹陷的数量η而得出的数量以下的细胞数分散到培养基，并 将所述培养基添加到所述培养容器的工序； b) 在所述培养容器内培养所述细胞12小时以上并使所述细胞形成为球状体的工序； c) 吸引20%以上的所述培养基之后注入同量的新鲜培养基的工序； d) 多次进行所述a)至c)的工序以使球状体成长的工序； e) 在使所述球状体成长到所希望的大小之后搅拌所述培养基以使各凹陷内的细胞悬 浮在所述培养基中的工序；以及 f) 利用吸引机针对每个所述培养基吸取所述细胞来回收所述细胞的工序。
【专利摘要】本发明提供一种培养容器，该培养容器能够高效地制作出大小均匀的球状体，通过设计能够容易实施培养基更换和细胞回收的微型空间构造而具有所设计的微型空间构造。该培养容器排列有具有底部(11)和开口部(12)的多个凹陷(10)。底部(11)具有半球状和圆锥台状中的任一种形状，开口部(12)由从与底部(11)之间的交界包围到凹陷(10)的端部的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成。此外，交界的等效直径为50μm以上且2mm以下，从底部(11)的底到端部的深度为等效直径的0.6倍以上且3倍以下，构成开口部(12)的壁形成有与底部(11)相连续的面，且相连续的面的倾斜在交界处发生变化。
【IPC分类】C12M3/00, C12N5/071
【公开号】CN105308170
【申请号】CN201480032635
【发明人】江尻洋子, 绫野贤, 福原直人, 谷口英树, 武部贵则
【申请人】株式会社可乐丽, 公立大学法人横滨市立大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年6月5日
【公告号】CA2914463A1, EP3006553A1, US20160137962, WO2014196204A1