50] 图14是表示实施例和比较例的培养基更换前后的球状体的图像的照片。
[0051] 图15是表示实施例的回收了细胞的前后的图像的照片。
[0052] 图16是表示实施例的从培养容器回收了的球状体的照片。
【具体实施方式】
[0053] 以下，参照附图对实施方式进行说明。为了使说明明确化，对以下的记载和附图进 行了适当省略和简化。在各附图中，对具有相同的结构或者功能的结构要素和相当部分标 注相同的附图标记，并省略其说明。
[0054] 实施方式1.
[0055] (培养容器）
[0056] 图1是表不一实施方式的培养容器的一例的图。在图1中不出了具有多个培养容 器1的培养板3的一部分。在图1的上部示出了从培养板3的上方观察形成于培养容器1 的底的多个凹陷10的一部分而得到的图。培养容器1配置有多个凹陷10。从培养容器1 的制造、细胞培养的效率的观点出发，优选的是，多个凹陷10规则地配置。培养容器1例如 相当于具有多个孔的孔板的一个孔。换言之，在孔板的各孔中配置有多个凹陷10。
[0057] 孔板是由带有多个凹陷（洞或者孔）的平板构成的实验?检测器件，各孔被用作试 验管或者浅底盘。孔的数量例如为6、24、96、384等，也可以是这些数量以上的数量。孔的 底除了是平坦的或者圆形的以外，也可以是由多个细长的微型管组合起来的形式的底（深 孔板）。
[0058] 另外，凹陷10因为形成作为用于培养细胞的微小的空间的微型空间，所以也能够 被称为微型容器。
[0059] 图2、图3是表不实施方式1的凹陷的形状例的图。图2表不从横向观察一个凹陷 10时得到的剖视图，图3表示从上方观察一个凹陷10时得到的图。图3所示的凹陷10是 图1的上部的凹陷10的详细结构例。
[0060] 各凹陷10由底部11和开口部12构成。底部11是构成培养容器1的底的部分， 开口部12是配置于底部11的上部的部分。将底部11和开口部12相接的部分记为交界。 在图2中，附图标记R的箭头所示的长度部分与交界的位置相对应。另外，在图3中，交界 的位置由双点划线表示。但是，底部11和开口部12由相连续的面构成，从而作为一体来制 造。
[0061] 在图2、图3中，对于形成于培养容器1的多个凹陷10而言，表示出等效直径R、深 度（高度）D。
[0062] 等效直径R是指与凹陷10的底部11内切的内切圆的直径。在这里，是指在底部 11和开口部12的交界处内切的内切圆的直径。更详细而言，等效直径R是指交界处的、与 凹陷10的高度Η的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。
[0063] 深度D是从底部11的内侧的底到凹陷10的上端的长度。凹陷10的上端与开口 部12的端部（上端）相同。深度D是凹陷10所形成的空间的深度。换言之，深度D是从 底部11所形成的空间的底到开口部12所形成的空间的上端的深度。在图2中除了凹陷10 的深度D以外，还示出了底部11的深度D1和开口部12的深度D2。
[0064] 底部11形成用于培养细胞的空间（第1空间）。底部11例如具有半球状的形状。 例如，能够使用将以等效直径R为直径的球形分为一半的形状。底部11的形状并不限定于 半球状。其他的具体例在实施方式2中说明。
[0065] 开口部12形成以辅助细胞的培养和回收的方式起作用的空间（第2空间）。开口 部12由从与底部11之间的交界包围到凹陷10的端部（顶端）的、锥角为1度以上20度 以下的壁构成。优选的是，构成开口部12的壁的锥角为5度以上且15度以下，更优选为10 度。其理由是：如果锥角过小，则在进行回收时细胞无法从凹陷转移到培养基，相反地如果 锥角过大，则在培养基更换中细胞将会脱离。
[0066] 在图2中，锥角由附图标记Θ1、Θ2表示。在图2、图3所示的凹陷10的形状例 中，示出了锥角Θ1、Θ2大致相同的情况。
[0067] 底部11和开口部12之间的交界以等效直径R为50μm以上且1mm以下的方式形 成。在想要将营养供给到球状体的中心部的情况下，优选等效直径为50μm以上且500μm 以下，更优选等效直径为100μm以上且500μm以下。其理由是：营养成分、氧只会通过扩 散而转移到细胞内，中心部不坏死的等效直径的大小被认为是300ym(EfremCurcioet al.，〃Masstransferandmetabolicreactionsinhepatocytespheroidsculturedin rotatingwallgas-permeablemembranesystem"，Biomaterials28(2007)5487-5497)， 为了不能达到该大小以上，优选上述直径。
[0068] 相反，像癌细胞那样，想要在细胞的中心部产生坏死的情况下 (FranziskaHirschhaeuseretal. ,^Multicellulartumorspheroids：An underestimatedtooliscatchingupagain"，JournalofBiotechnology 148 (2010) 3-15,Figl)，优选等效直径R为400μm以上且不足2mm。其理由是：如上所述， 考虑到在等效直径为300μπι时营养将会输送到中心部而无法引起坏死的情况。因此，为了 获得300μm以上的直径的球状体，等效直径必须为400μm以上。
[0069] 此外，以从底部的底到端部的深度D为等效直径R的0. 6倍以上且3倍以下的方 式形成。优选的是，深度D为等效直径R0. 7倍以上且1. 2倍以下，更优选深度D为等效直 径R的0. 8倍~1倍。
[0070] 另外，对于培养容器1，优选相邻的两个凹陷10之间是平坦的。例如，优选两个凹 陷10的距离为从5μπι到50μπι的范围。其理由是：为了高效地获得大量的球状体，优选 增加单位面积的球状体数以进行高密度培养。因此，未形成球状体的壁的上表面越小越好。 但是，在锥角很小的情况下如果壁较薄，则由于细胞接种时、培养基更换时的振动将有可能 容易产生龟裂。因此，优选两个凹陷10的距离为5μπι以上。根据这样的观点，优选两个凹 陷10的距离为5μm~20μm。
[0071] 与此相反，也可以是相邻的两个凹陷10相接触。例如，可以是两个凹陷10的端部 的一部分相接触，并且开口部12的锥角的斜面相接触而形成为山形的形状。
[0072] 除上述形状以外，培养容器1优选通过以下那样的方式制造。
[0073] 培养容器1优选是由丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯 乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树 月旨、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂以及有机硅树脂中的一种或者它们的组合形成的树脂成 形品。
[0074] 优选的是，对于培养容器1所具有的各凹陷10,利用等离子体处理、玻璃涂覆、电 晕放电、UV臭氧处理中的任一种方法或者由这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成 官能团，以水接触角为45度以下的方式进行处理。
[0075] 此外，优选的是，向各凹陷10固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物链。优 选的是，将亲水性的聚合物链向以上述水接触角为45度以下的方式处理过的各凹陷10固 定。
[0076] 此外，优选的是，向各凹陷10固定有磷脂或者磷脂?高分子复合物。更加优选的 是，该固定处理是针对上述那样以水接触角为45度以下的方式处理过的各凹陷10、固定有 亲水性的聚合物链的各凹陷10或者将这些组合起来的各凹陷10来实施的。
[0077] 而且，优选的是，针对各凹陷10,利用等离子体处理、玻璃涂覆、电晕放电、UV臭氧 处理中的任一种方法或者由这些方法组合而成的表面改性处理方法来形成官能团，并以水 接触角为45度以下的方式进行处理后，获得固定有用于阻碍细胞粘附的亲水性的聚合物 链以及磷脂或者磷脂?高分子复合物中的任一种聚合物的细胞非粘附表面。更加优选的是， 该处理与上述各处理、或者各处理的组合处理一起实施。
[0078] 另外，上述亲水性的聚合物链优选为聚甲基丙烯酸羟乙酯，而且，更优选为聚甲基 丙烯酸羟乙酯的平均分子量为10万以上。
[0079] (培养方法）
[0080] 接着，说明使用图1至图3所示的培养容器1的细胞的培养方法。
[0081] 细胞的培养按照以下各工序实施。
[0082] a)将分散有细胞的培养基添加至培养容器1的工序
[0083] b)培养细胞的工序
[0084] c)更换培养基的工序
[0085] d)使球状体成长的工序
[0086] e)使球状体在培养基中悬浮的工序
[0087]f)回收细胞的工序
[0088] 上述的各工序也能够划分为：从a)到d)是培养细胞的工序（细胞培养工序），e)、 f)是回收细胞的工序（细胞回收工序）。
[0089] 在这里，球状体是由多个细胞聚集在一起而形成细胞块且成为三维状态的物体。
[0090] 以下说明各工序。
[0091] a)将分散有细胞的培养基添加至培养容器1的工序
[0092] 作为准备培养细胞的工序，将以下总数的细胞分散到培养基中，并将培养基添加 至培养容器1。
[0093] 总细胞数的下限是存在于培养容器1的凹陷10的数量（η)以上。
[0094] 总细胞数的上限是将培养容器1所具有的凹陷10的体积（V)除以所接种的细胞 的体积（ν)得到的数值乘以凹陷的数量（η)而得出的数量以下。用带有符号的公式来表示 时，能够表示为细胞总数的上限値=V/vXn。在这里，前提是多个凹陷10的体积（V)是相 同的。在体积不同的情况下使用平均值。
[0095] 培养基根据所培养的细胞进行调整。
[0096] b)培养细胞的工序
[0097] 在培养容器1内培养细胞12小时以上，并使细胞形成为球状体。在向培养容器1 添加培养基时，分散到培养基的细胞进入凹陷10并在各凹陷10内培养。优选的是，一个细 胞分别进入各凹陷10中，而在底部11所形成的空间内形成一个球状体。在各