一种体内检测car-t细胞数的方法
【专利摘要】本发明公开了一种体内检测CAR?T细胞数的方法，包括如下步骤：(1)构建标准品，步骤如下：针对CAR?T细胞的靶点基因设计特异性引物；使用PCR技术扩增出相应靶点基因特异性片段，并连接重组到T载体中；将重组质粒转化到大肠杆菌中进行表达扩增，纯化和测序鉴定；根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测样本进行绝对定量；(2)待测样本处理，步骤如下：抽提样本的全基因组；检测待测样本基因组的浓度和纯度；运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；(3)数据处理。本发明操作方便，测量结果精确，通过定期抽取患者全血或骨髓，可获知CAR?T细胞在体内的变化情况，对患者进一步细胞治疗方案提供依据。
【专利说明】
一种体内检测CAR-T细胞数的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体内CAR-T细胞数检测技术领域，尤其涉及一种体内检测CAR-T细胞数 的方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的细胞治疗始于上世纪80年代。第一代细胞治疗技术属于采用非特异性的细 胞治疗，其主要方法包括LAK、NK、CIK等。第二代细胞治疗技术兴起于上世纪90年代，主要代 表为DC-CIK，这种治疗技术属于诱导肿瘤特异性细胞治疗。第一代和第二代细胞治疗技术 由于疗效有限等原因，在美欧等主要国家已几乎不再开展。第三代细胞治疗技术始于本世 纪初，属于基因重组细胞治疗，主要有CAR-T、CAR-NK等。其中，最新的CAR-T技术不仅解决了 T细胞的靶向性、杀伤性的问题，还解决了其体内有效增殖的难题。目前如何确定体内CAR-T 细胞的数量，获知CAR-T细胞在体内的变化情况，进而对患者的进一步细胞治疗方案提供依 据，成为目前亟需解决的技术问题。
【发明内容】
[0003] 本发明提出了一种体内检测CAR-T细胞数的方法，操作方便，测量结果精确，通过 定期抽取患者全血或骨髓，可获知CAR-T细胞在体内的变化情况，对患者进一步细胞治疗方 案提供依据。
[0004] 本发明提出的一种体内检测CAR-T细胞数的方法，包括如下步骤：
[0005] (1)构建标准品，步骤如下：
[0006] S1、针对CAR-T细胞的靶点基因设计一对特异性引物；
[0007] S2、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；
[0008] S3、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；
[0009] S4、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测 样本进行绝对定量；
[0010] 其中，拷贝数计算公式为:拷贝数=6 · 02 X 1023 X核酸浓度+ (DNA 1 ength X 660); 拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml;
[0011] (2)待测样本处理，步骤如下：
[0012] S1、抽提样本的全基因组；
[0013] S2、检测待测样本基因组的浓度和纯度；
[0014] S3、运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；
[0015] ⑶数据处理
[0016] 将荧光定量PCR仪得到的目的基因的具体拷贝数换算得出每微克中含目的基因的 拷贝数，进而得出CAR-T细胞的数量。
[0017 ] 优选地，在构建标准品过程中，CAR-T细胞的靶点基因为CD 19、EpCAM、EGFR、HER2、 CD123 和/或 LMP1。
[0018] 优选地，在待测样本处理过程中，样本包括患者的全血和/或骨髓。
[0019] 本发明可有效检测出体内CAR-T细胞的细微变化。进一步的以肿瘤靶向性T细胞 (CAR-T)治疗为主的细胞生物治疗服务，包含的肿瘤靶点有：CD19、EpCAM、EGFR、HER2、 CD123、LMP1，独立构建关于肿瘤靶点的质粒为标准品，运用荧光定量PCR技术检测体内CAR-T细胞数的变化情况，进而为患者病情评估和治疗方案提供有力依据。在临床上，通过定期 抽取患者全血或骨髓，可获知CAR-T细胞在体内的变化情况，对患者进一步细胞治疗方案提 供依据。
【具体实施方式】
[0020] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0021] 实施例1
[0022] -种体内检测CAR-T细胞数的方法，包括如下步骤：
[0023] (1)构建标准品，步骤如下：
[0024] S1、针对CAR-T细胞的靶点基因设计一对特异性引物；
[0025] S2、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；
[0026] S3、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；
[0027] S4、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测 样本进行绝对定量；
[0028] 其中，拷贝数计算公式为：(：(^丨68 = 6.02\ 1023 \核酸浓度+(0嫩161^让\660); copies单位为ml，核酸浓度单位为g/ml;
[0029] (2)待测样本处理，步骤如下：
[0030] S1、抽提样本的全基因组；
[0031] S2、检测待测样本基因组的浓度和纯度；
[0032] S3、运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；
[0033] (3)数据处理
[0034] 将荧光定量PCR仪得到的目的基因的具体拷贝数换算得出每微克中含目的基因的 拷贝数，进而得出CAR-T细胞的数量。
[0035] 实施例2
[0036] -种体内检测CAR-T细胞数的方法，包括如下步骤：
[0037] (1)构建标准品，步骤如下：
[0038] 31、针对0厶1?-1'细胞的靶点基因（0)194?0厶146?1?、冊1?2、0)123和/或110 31)设计一 对特异性引物，如下表1所示；
[0039] 表1针对CAR-T细胞的靶点基因 （CD 19、EpCAM、EGFR、HER2、CD 12 3和/或LMP1)设计的 一对特异性引物表
[0041] S2、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；
[0042] S3、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；
[0043] S4、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测 样本进行绝对定量；
[0044] 其中，拷贝数计算公式为:拷贝数=6.02 X 1023 X核酸浓度+ (DNA length X 660); 拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml;
[0045]标准品可以根据拷贝数计算公式稀释成105、104、103、10 2，由此可得到一个标准曲 线，仪器就可检测出该样本的拷贝数。
[0046] (2)待测样本处理，步骤如下：
[0047] S1、抽提样本的全基因组，其中样本包括患者的全血和/或骨髓；
[0048] S2、检测待测样本基因组的浓度和纯度;其中，实验室通过采用紫外-可见光分光 光度计可直接检测出对样本基因组的浓度和纯度；
[0049] S3、运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；
[0050] (3)数据处理
[0051] 将荧光定量PCR仪得到的目的基因的具体拷贝数换算得出每微克中含目的基因的 拷贝数，进而得出CAR-T细胞的数量。
[0052] 具体的，通过分光光度计可获知待测样本的浓度，取?μL样本作为模板进行荧光定 量PCR检测，得到该ΙμL模板的拷贝数，由于该ΙμL样本的浓度已知，可计算出lyg含目的基因 的拷贝数，进而得到CAR-T细胞的数量。
[0053]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种体内检测CAR-T细胞数的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 构建标准品，步骤如下： 51、 针对CAR-T细胞的靶点基因设计一对特异性引物； 52、 通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒； 53、 将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒； 54、 根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测样本 进行绝对定量； 其中，拷贝数计算公式为:拷贝数=6.02 X IO23 X核酸浓度+ (DNA Iength X 660);拷贝 数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml; (2) 待测样本处理，步骤如下： 51、 抽提样本的全基因组； 52、 检测待测样本基因组的浓度和纯度； 53、 运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数； (3) 数据处理 将荧光定量PCR仪得到的目的基因的具体拷贝数换算得出每微克中含目的基因的拷贝 数，进而得出CAR-T细胞的数量。2. 根据权利要求1所述的体内检测CAR-T细胞数的方法，其特征在于，在构建标准品过 程中，CAR-T 细胞的靶点基因为CD 19、EpCAM、EGFR、HER2、CD 123和/或LMP1。3. 根据权利要求1所述的体内检测CAR-T细胞数的方法，其特征在于，在待测样本处理 过程中，样本包括患者的全血和/或骨髓。
【文档编号】C12Q1/06GK105950761SQ201610483001
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】凌发忠, 许国贞, 刘振云, 熊伍平, 程丰伟
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司