本发明涉及一种细胞模型，尤其是SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型的构建方法。
背景技术：
胰腺病变是目前人体疾病中发病机制最为复杂的疾病之一，其炎症性病变病情危重，治疗难度大；而其肿瘤性疾病则难以早期发现，死亡率较高，治疗效果不佳。大多数胰腺炎症及肿瘤多由导管上皮细胞病变产生，然而目前对于胰腺导管上皮细胞的分离培养难度较大，使得胰腺病变的研究受到极大的限制。目前，国外对原代大鼠胰腺导管上皮细胞体外培养的研究主要集中于上世纪70年代，主要方法为：直接切除大鼠胰腺头部组织，在体视显微镜下分离主胰管区域，置于胶原酶XI中消化后再次于体视显微镜下分离出主胰管，最后再依次经胶原酶XI、中性蛋白酶I及胰酶消化后收集离心沉淀物做原代培养。该方法的不足之处为直接切除的胰腺头部组织中包含的组织成分过多，且必须经过体视显微镜方可分离。而国内对原代大鼠胰腺导管上皮细胞体外培养的报道集中于本世纪初。主要有两种方法：一种是经胆管注入Ⅴ型胶原酶后取出胰腺组织剪碎，经筛网过滤后行Ficoll（一种分离方法的名称）不连续密度梯度离心，最后收集顶层和中层液体做原代培养。该方法的不足在于筛网选择难度较大，且Ficoll液需要新鲜配制，梯度离心的设备需求较高，操作繁琐且成功率不高。另一种是直接分离SD乳鼠的胰腺组织，剪碎后经Ⅳ型胶原酶消化，收集离心沉淀物做原代培养，该方法最大的不足在于获得的大部分为胰腺胰岛细胞，导管上皮细胞的获得率较低。而现有的胰腺导管上皮细胞分离方法操作过于繁琐，且成功率较低。如需要进行胰腺导管相关病变的进一步研究，则目前的导管上皮细胞分离方法难以胜任。因此，建立一种成功率高，操作简便的大鼠胰腺导管上皮细胞模型是当务之急。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种胰腺导管上皮细胞获得率高、建立和操作简便的SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型的构建方法，为胰腺疾病的研究提供有力的工具。
SD大鼠是实验用的一种大鼠，全称为Sprague Dawley ，学术上简称为SD大鼠。
为达上述目的，本发明的具体技术方案为：
一种SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型的构建方法，它包括大鼠，其特征在于还包括以下步骤：
1、动物选择及麻醉，择用体重300～400g雄性SD大鼠壹只，并对其作腹腔注射麻醉；
2、大鼠主胰管的外科分离，对麻醉后的雄性大鼠作腹部消毒，在腹部正中切口打开腹腔，找到出胰腺，切下主胰管，放入培养皿加入培养液培养，得主胰管；
3、主胰管化学消化，将步骤2获得的主胰管放入离心管，分别加入胶原酶、溶液PBS和蛋白酶相关的消化溶液进行水浴消化与震荡分离，将胰腺导管上皮细胞分离成包含在悬液及漂浮组织中，用移液器吸出离心管内的悬液及漂浮组织置入无菌离心管内收集，加入培养液，得胰腺导管上皮细胞悬液及漂浮组织；
4、细胞类型鉴定，取经化学消化后无菌离心管内包含胰腺导管上皮细胞的悬液及漂浮组织，采用免疫印迹法检测细胞中的细胞角蛋白19和细胞角蛋白7，表达为阳性者为胰腺导管上皮细胞，成为SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型。
所述的腹腔注射麻醉为10%水合氯醛，注射量与SD大鼠体重的比例为0.3ml/100g。
所述的主胰管化学消化包括以下步骤：
（1）将分离后的主胰管放入预先准备的10ml离心管，离心管内置有浓度为2 mg/ml的胶原酶XI 5ml；
（2）将该离心管及其内物放入37℃水浴消化12分钟，每间隔4分钟剧烈震荡一次；
（3）用移液器吸弃离心管内悬液及漂浮组织；
（4）在离心管中加入2ml的胶原酶XI，37℃水浴消化5分钟，分别于1、3、5min各震荡1次；
（5）在离心管中加入5ml PBS溶液终止消化，弃去PBS及漂浮物，重复此步骤1次；
（6）在离心管中加入4ml无菌PBS和1ml浓度为2U/ml的中性蛋白酶后37℃水浴12分钟，每间隔4分钟剧烈震荡一次；
（7）在离心管中加入PBS 5ml溶液终止消化，吸出悬浮液，重复此步骤1次，进一步去除残留的其他组织细胞成分；
（8）将离心管及其内物置于37℃水浴中以0.1%胰酶消化3分钟，加0.5ml FBS溶液终止消化，共重复5次，其中第1次消化后将悬液弃掉；第2~5次消化后将悬液用10ml无菌离心管收集，从第3次消化起用移液器反复吹打多次；之后以1000转/分转速离心5分钟；之后加入2ml培养液（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗）重悬后接种于24孔板中，48小时后观察细胞贴壁情况。
本发明SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型的构建方法，根据SD大鼠的胰腺解剖结构直接肉眼下分离主胰管，对胰腺导管上皮细胞的分离获得率较高，所得的胰腺导管上皮细胞受到刺激较少，能稳定传代。方法简便易行，成功率高，为胰腺疾病的研究提供了来源丰富可靠的新型细胞模型。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
1、动物选择及麻醉，择用体重350g雄性SD大鼠壹只，采用10%水合氯醛，注射量与SD大鼠体重的比例为0.3ml/100g。
2、大鼠主胰管的外科分离，步骤为（1）腹部碘伏及75%酒精消毒3遍；（2）腹部正中切口打开腹腔；（3）沿胃找到十二指肠，翻出胰腺；（4）辨认和分离胆管、主胰管；（5）切下主胰管，放入30mm×10mm培养皿并加入2~3ml PBS溶液，在肉眼下用虹膜剪和显微镊分离、切除主胰管周边组织，得主胰管。
3、主胰管的化学消化，将步骤2获得的主胰管放入超净工作台进行后续操作，步骤为：
（1）将分离后的主胰管放入预先准备的10ml离心管，离心管中含有浓度为2 mg/ml的胶原酶XI 5ml进行消化；
（2）将该离心管及其内物放入37℃水浴消化12分钟，每间隔4分钟剧烈震荡一次，200次/分，持续15秒，在于将管内物质充分混匀；
（3）用移液器吸弃离心管内悬液及漂浮组织；
（4）在离心管中加入2ml的胶原酶XI，37℃水浴消化5分钟，分别于1、3、5min各震荡1次，200次/分，持续15秒，将管内物质充分混匀；
（5）在离心管中加入5ml PBS溶液终止消化，弃去PBS及漂浮物，重复此步骤1次，将管内残留的物质充分洗净；
（6）在离心管中加入4ml无菌PBS溶液和1ml浓度为2U/ml的中性蛋白酶后37℃水浴12分钟，每间隔4分钟剧烈震荡一次，200次/分，持续15秒，将管内物质充分混匀；
（7）在离心管中加入PBS溶液5ml终止消化，吸出悬浮液，重复此步骤1次，将管内残留的物质充分洗净；
（8）将离心管及其内物在37℃水浴中以0.1%胰酶消化3分钟，加0.5ml FBS溶液终止消化，共重复5次，其中第1次消化后将悬液弃掉。第2~5次消化后将悬液用10ml无菌离心管收集，从第3次消化时用移液器反复吹打多次；从第3次消化起用移液器反复吹打多次，之后以1000转/分转速离心5分钟；之后加入2ml培养液（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗）重悬后接种于24孔板中，48小时后观察细胞贴壁情况。细胞贴壁良好，可见细胞伪足伸出，细胞间建立起稳定的细胞连接。
4、细胞类型鉴定，取经化学消化后的主胰管，采用免疫印迹法检测细胞中的细胞角蛋白19和细胞角蛋白7，细胞中同时存在CK7和CK19表达均为阳性者为胰腺导管上皮细胞，免疫印迹法重复三次以确认结果。
5、结论：观察到细胞呈梭型，贴壁紧密，细胞质开始延展，并伸出伪足。通过免疫印迹法对所得细胞中细胞角蛋白19和细胞角蛋白7的表达进行检测，两者同时呈阳性表达则成功构建SD大鼠胰腺导管上皮细胞模型。
所述水浴消化指的是加入消化物质后放在水里面进行消化作用的过程。
所述伪足为细胞贴壁延伸的主要现象之一，说明细胞存活生长良好。
以上所述，仅是本发明的主要技术步骤而已，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。